蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖、多肽綜合提取分離的工藝研究

雷燕妮，張小斌，陳書存，劉長霞，李多偉

(1.商洛學院 陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西 商洛 726000；2.商洛市中醫醫院，陜西 商洛 726000；3.西安宇沐生物技術研究院有限公司，陜西 西安 710001；4.西北大學 生命科學學院，陜西 西安 710069)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(Fr)Link]屬子囊菌亞門(Ascomyxotina)麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬[1,2]，與冬蟲夏草同屬，是一種具有滋補作用的營養品和中藥。隨著蛹蟲草種植面積的不斷擴大，采收蛹蟲草子實體后的大量菌渣被廢棄，或僅作為飼料、肥料使用，并沒有得到充分利用。有資料表明，采收蛹蟲草后的菌渣中尚含有大量蟲草素、多糖及蛋白質等[3,4]，蟲草素具有抗病毒、抑菌、明顯抑制腫瘤生長，與環磷酰胺有明顯的協同作用，并有降血糖的作用。蟲草多糖具有提高機體免疫功能，抑制腫瘤作用[5～7]。

如何合理充分利用蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖這些功效成分，以及將所含有的大量蛋白質轉化為具有功效作用的多肽是很多學者關注的問題[8,9]，這些多肽不僅有比蛋白質和氨基酸更好的消化吸收性能，還有促進蟲草素、多糖等功效成分的吸收與轉化，調節人體生理機能、預防疾病、增強機體抵抗力、清除自由基、改善氮素吸收關系、促進礦物質運輸吸收，以及調節食品風味與質地等作用。

筆者研究采用熱回流和超聲波提取技術，利用專項酶切技術把蛹蟲草菌渣中蛋白質轉化為的多肽[10,11]、蟲草素及多糖等分別提取出來，獲得蟲草素、多糖、多肽健康食品原料，旨在為進一步開發蛹蟲草健康食品、保健品等人類健康服務提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

蛹蟲草菌渣由西安宇沐生物技術研究院有限公司蛹蟲草種植實驗基地提供，樣品于65℃干燥后粉碎過40目篩備用。蛹蟲草由李智選研究員(西北大學生命科學學院植物教研室)鑒定為麥角菌科蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(Fr)Link]。

蟲草素對照品：為Sigma公司產品；甲醇、乙腈為色譜純；葡萄糖、乙醇、三氯乙酸、乙酸、硼酸、磺基水楊酸、鄰苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器

美國 Waters公司1525型高效液相色譜、上海鈮歐儀器有限公司2000B型旋轉蒸發儀、林茂科技(北京)有限公司SHB-IIIA循環水式真空泵、上海博訊HH.S21-4型數顯電熱恒溫水浴鍋、日本島津公司UV-265型紫外分光光度計、梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司AB-204N精密電子天平、廣州吉迪儀器有限公司JIDI-6D臺式低速大容量離心機、寧波新芝儀器設備有限公司SB-4200DT超聲提取器、安徽科博瑞環境科技有限公司KBR-TU-1812多功能膜設備、上海和晟儀器科技有限公司實驗室小型真空干燥箱、武漢理科光電技術有限公司FW-100型高速萬能粉碎機等。

2 實驗及結果分析

2.1 含量分析測試方法

蟲草素含量采用HPLC法測定，蟲草多糖含量采用苯酚-硫酸法測定[12]，蟲草多肽含量采用HPLC法測定和UV法測定[13,14]。

2.2 蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖、多肽綜合提取分離工藝流程

取蛹蟲草菌渣粉末10.00g用水或醇經熱回流提取或超聲波提取，過濾，濾液用5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子蟲草素的濾出液和含有大分子多糖、蛋白質的濾余液，濾出液濃縮干燥得蟲草素提取物產品，濾余液用蛋白酶酶解，再經5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子多肽的濾出液和含有大分子多糖的濾余液，濾出液、濾余液分別濃縮干燥得多肽提取物產品和多糖提取物產品。

2.3 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取的單因素實驗

2.3.1 選擇綜合提取蛹蟲草菌渣中蟲草素、多糖、蛋白質的方法和溶劑 取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取4份，每份5 g，按液料比10∶1的比例分別加入水、濃度35%乙醇溶液、濃度55%乙醇溶液和濃度75%乙醇溶液各100 mL于250 mL燒瓶中，95℃熱回流提取2.5 h，離心過濾，濾液定容至250 mL，分別測定濾液中蟲草素、多糖和蛋白質的含量，見表1。

取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取4份，每份5 g，按液料比10∶1的比例分別加入水、濃度35%乙醇溶液、濃度55%乙醇溶液和濃度75%乙醇溶液各100 mL于250 mL燒瓶中，超聲提取1.0 h，離心過濾，濾液定容至250 mL，分別測定濾液中蟲草素、多糖和蛋白質的含量，見表1。

表1 不同提取方法和不同提取溶劑對蟲草素、多糖和蛋白質的提取效果(n=3)

從表1可以看出，對蟲草素而言，乙醇提取與水提取相差不大；水超聲提取(0.0188%)略高于水熱回流提取(0.0172%)；醇超聲提取(0.0205%)略高于醇熱回流提取(0.0184%)。

對蟲草多糖而言，水提取遠大于乙醇提取；水熱回流提取(4.02%)遠大于水超聲提取(0.89%)。

對蟲草蛋白質而言，水提取遠大于乙醇提?。凰曁崛?16.68%)略高于水熱回流提取(15.42%)。從提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合考慮應采用水熱回流提取為最佳。水熱回流提取既可以提取出蟲草素，又可以提取出蟲草多糖和蛋白質，可以充分利用原料，減少生產成本。

2.3.2 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取的單因素實驗 在多次預試驗的基礎上，取5 g過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉加入80 mL水，95℃熱回流提取2.5 h，提取1次，提取液離心過濾，濾液定容至250 mL，分別測定濾液中蟲草素、多糖和蛋白質的含量為基礎條件，分別考察提取溫度(35℃、55℃、75℃、95℃)，液料比(8∶1、12∶1、16∶1、20∶1)，提取時間(1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h )和提取次數(1次、2次、3次、4次)4個因素對蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取率的影響，選定各因素對蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取率影響較大的水平，結果見表2、表3、表4、表5。

表2 不同提取條件對蛹蟲草菌渣提取蟲草素的影響(n=3)

表3 不同提取條件對蛹蟲草菌渣提取多糖的影響(n=3)

表4 不同提取條件對蛹蟲草菌渣提取蛋白質的影響(n=3)

表5 蛹蟲草菌渣綜合提取正交表L9(34)及結果

從表2、3、4可以看出：在相同條件下，熱回流提取隨提取次數的增加蟲草素、多糖和蛋白質提取率提高，但在熱回流提取3次后蟲草素、多糖和蛋白質提取率增加緩慢，分析其原因可能是提取3次后溶質濃度差大大降低，物質基本被浸出，提取率增加緩慢。由于熱回流提取次數的延長會大大增加生產成本，故熱回流提取的次數確定為3次為宜。

在相同條件下，熱回流提取隨時間的延長蟲草素、多糖和蛋白質提取率在增加，但在熱回流2h后蟲草素、多糖和蛋白質提取率增加緩慢，分析其原因可能是提取2h后溶質濃度差大大降低，物質基本被浸出，提取率增加緩慢。由于熱回流提取時間的延長會大大增加生產成本，故熱回流提取的時間控制在2 h以內。

在相同條件下，熱回流提取隨液料比的提高蟲草素、多糖和蛋白質提取率在增加，但在液料比16∶1后蟲草素、多糖和蛋白質提取率增加緩慢，分析其原因可能是溶劑量的加大提高了溶液濃度差，利于物質的傳質，液料比16∶1后的溶出度基本上達到平衡，所以蟲草素、多糖和蛋白質的含量不在隨液料比的增加而明顯增加，故熱回流提取的液料比確定為16∶1。

在相同條件下，熱回流提取隨溫度的增加蟲草素、多糖和蛋白質提取率在增加，但是蟲草素、多糖和蛋白質對提取溫度要求不一樣，在熱回流溫度達75℃后蟲草素提取率開始增加緩慢，在熱回流溫度達95℃多糖提取率才達到最高，在熱回流溫度達55℃后蛋白質提取率開始增加緩慢，分析其原因可能是蟲草素、蛋白質易溶于溫水及熱水，多糖易溶于熱水，所以出現對溫度要求不一樣的現象，但是并沒有發生對溫度敏感的現象出現。綜合分析蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質的單因素實驗，確定最佳的提取條件是：在液料比16∶1的條件下，95℃熱回流提取3次，每次提取2.0 h。

2.4 正交試驗確定蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取最佳條件

以2.3蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質的單因素實驗不同的提取次數、不同的提取時間、不同的液料比和不同的提取溫度實驗結果為參考，為探討各工藝參數之間相互交叉的相互影響，用正交實驗來研究確定蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取的最佳工藝參數。從單因素實驗結果可看出熱回流提取各單因素對蟲草素、多糖和蛋白質提取的影響成正相關，且多糖比蟲草素、蛋白質要求溫度要高，故以測定多糖含量來作為正交實驗的數據進行分析。

蛹蟲草菌渣綜合提取正交表L9(34)及結果見表5，蛹蟲草菌渣綜合提取直觀分析見表6，蛹蟲草菌渣綜合提取方差分析見表7。

表6 蛹蟲草菌渣綜合提取率直觀分析結果

表7 蛹蟲草菌渣提取綜合提取得率方差分析結果

按正交表L9(34)設計安排，取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取9份，每份5 g，在提取次數1、2、3，提取時間2.5 h、2.0 h、1.5 h，液料比8∶1、12∶1、16∶1，提取溫度55℃、75℃、95℃的條件下熱回流提取，提取液離心過濾，濾液定容至250 mL，測定濾液中多糖的含量。

通過正交試驗表6直觀分析、表7方差分析，影響實驗效果的因素分別是熱回流提取的提取溫度、熱回流提取液料比、熱回流提取時間和熱回流提取次數。按效益生產原則可確定最佳的提取條件為A3、B3、C2、D2,即用水作為提取溶劑，按液料比16∶1在95℃下熱回流提取2次，每次2.0 h。

2.5 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取驗證實驗

取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取3份，每份200 g，液料比16∶1，提取溫度95℃的條件下熱回流提取2次，每次提取時間2.0 h，提取液離心過濾，濾液減壓濃縮至膏狀，在真空干燥，粉碎。分別測定樣品中蟲草素、多糖和蛋白質的含量，見表8。

表8 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取實驗結果(n=3)

蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取驗證實驗結果表明，用水熱回流提取蟲草素、多糖和蛋白質提取率高，操作簡單，工藝穩定。

2.6 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取分離實驗

取過40目篩的蛹蟲草菌渣粗粉，精密稱取3份，每份200 g，液料比16∶1，提取溫度95℃的條件下熱回流提取2次，每次提取時間2.0 h，提取液離心過濾，濾液用5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子蟲草素的濾出液和含有大分子多糖、蛋白質的濾余液，濾出液濃縮干燥得蟲草素提取物產品，濾余液用蛋白酶酶解，再經5 000分子量超濾膜過濾，收集含有小分子多肽的濾出液和含有大分子多糖的濾余液，濾出液、濾余液分別濃縮干燥得多肽提取物產品和多糖提取物產品。分別測定提取物樣品中蟲草素、多糖和蛋白質的含量，見表9。

表9 蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取分離實驗結果(n=3)

蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取分離驗證實驗結果表明，用水熱回流提取蟲草素、多糖和蛋白質，在經膜分離，酶解，膜分離可以獲得蟲草素提取物、多糖提取物和多肽提取物產品，方法提取分離率高，操作簡單，工藝穩定。

3 討論

(1)筆者研究利用蛹蟲草菌渣，采用熱回流綜合提取方法和超聲綜合提取方法，選用水和乙醇作為提取溶劑，由于濃度35%～55%的乙醇已不利于多糖的提取，故綜合提取工藝采用水提取法；雖然超聲波提取具有加速植物中有效成分進入溶劑，增加提取率等諸多有利因素，但由于多糖提取溫度是主要影響因子，而超聲波提取由于設備限制溫度控制在65℃以下，此溫度也不利于多糖的溶出，故選用水熱回流提取法進行蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質的綜合提取分離。

(2)在單因素分析的基礎上，通過正交實驗優化確定最佳提取工藝。實驗結果表明，影響蟲草素、多糖和蛋白質提取的因素主次順序為提取溫度>液料比>提取時間>提取次數，最佳提取條件為：提取溫度95℃，液料比16∶1，提取時間2.0 h，提取次數2。在該工藝條件下，蟲草素、多糖和蛋白質轉化率分別為91.98%、93.65%、93.35%。

(3)利用蛹蟲草菌渣提取蟲草素、多糖和蛋白質綜合提取驗證實驗獲得的最佳提取工藝進行提取，并通過膜分離技術、酶解技術有效的將蟲草素、多糖和多肽進行分離，使一次投料可以獲得蟲草素、多糖和多肽三種提取物產品，提取率和含量分別為1.84%、5.05%，5.74%、65.53%，4.46%、80.12%。