秦巴山區黑木耳遺傳多樣性初探

張耀玲,陳榮信,荊 丹,黃 重,魏芳勤,劉 勇

(1.漢中市農業技術推廣與培訓中心,陜西，漢中 723000；2.榆林市農產品質量安全中心, 陜西 榆林 719000)3.留壩縣農業技術推廣中心, 陜西 留壩 724100)

0 前言

秦巴山區已成為中國西北地區規模最大的食用菌生產基地。秦巴山區氣候溫潤，當地產出的黑木耳品質好，肉質較厚，商品性強；秦巴山區有豐富的林木和農作物秸稈資源，黑木耳野生資源遍布山區，栽培黑木耳有獨特的地理優勢、原料優勢和資源優勢[4]。因此提高我省黑木耳品種產量和品質，增加食用菌產業效益，提高種植戶和企業收入，推動秦巴山區食用菌產業發展具有重要意義。但是，近年來市場上對黑木耳品種管理混亂，存在相互引種并自主命名的不良現象，導致栽培黑木耳菌株貌似種類很多，但實際上大多是同一個木耳品種冠以不同的名稱，這給新品種栽培管理、品種審定、品種推廣帶來很大的難題[1]。然而傳統的生物學形態鑒別的方法易受環境因素和營養條件的影響，周期較長，鑒別結果分歧較大[2]。所以對黑木耳種質資源遺傳多樣性進行分析和評價，鑒定品種，明確菌株間的親緣關系是目前迫在眉睫的工作。筆者研究通過對木耳ITS序列進行擴增，結合拮抗實驗，對13個木耳種質資源進行了親緣關系分析鑒定。

1 材料方法

1.1 供試菌株

陜西漢中黑木耳主栽品種12個(表1)，保藏于漢中市農業科學研究所食用菌實驗室。其中13號野生菌株為采自周邊無人工栽培黑木耳的深山，采樣后帶回實驗室進行菌株分離工作。

表1 供試品種

1.2 供試菌株的分離純化及培養

1.2.1 菌絲生長速度的測定 采用平板培養法，于25℃黑暗培養，采用十字交叉法測定黑木耳菌落直徑。每個處理重復3次。

1.2.2 拮抗試驗 每個平板均接入3種木耳菌株，25℃下培養15～20 d，觀察菌種相交區域之間是否有拮抗現象發生和拮抗線是否明顯，每個處理重復3次。

1.3 DNA提取

采用PDA液體培養基，150 rpm，25℃ 培養菌絲，菌絲生長致密后，收集菌絲于-20℃保存備用，采用CTAB法提取DNA。

1.4 ITS反應體系

通用引物ITS1和ITS4各1 μL，DNA:1 μL，2*Mix:10 μL，PCR總體積20 μL，PCR完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，送測序。

1.5 ITS系統發育樹的構建

采用軟件ClustalW 2.0，進行DNA序列比對，用MEGA 6.0進行系統發育分析，以NJ法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 木耳菌絲生長特性

如表2所示，被測試木耳菌株菌絲特征差異較大，主要表現在菌絲形態、菌絲生長速度、耳基出現的時間及色素分泌情況。菌絲生長速度最快的是菌株Cxin6，吃料能力最強的菌株是C657；菌株C916生長速度最緩慢，菌絲吃料能力也較差；菌株菌株G2和G1耳基出現的最晚，菌株L2611耳基出現的最早，菌株G2 、S16、CO2無色素分泌，菌株L2611和S1與其他菌株之間生長速度差異達到了極顯著水平。漢中首個通過省級登記的黑木耳品種S1菌絲較白皙，分泌出黃褐色色素，菌絲粗壯、濃密。自分離的zbxin菌絲體白皙，分泌出深黃褐色色素，菌絲粗壯、較濃密、絮狀，菌絲生長速度較快，吃料能力強。

表2 木耳菌絲體形態特征

2.2 黑木耳菌株ITS-PCR結果

用引物ITS1和ITS4將基因組DNA擴增后，經核酸電泳檢測，發現目的片段都在500～750 bp之間，如圖1所示。用軟件ClustalW 2.0，進行DNA序列比對,然后構建進化樹，如圖2所示。

圖1 木耳菌絲ITS PCR電泳

圖2 基于ITS構建的系統發育樹

從進化樹來看，T16與zbxin親緣關系最近，菌絲特性幾乎完全一致。木耳S1與菌株T261、L2611、L261-1、Cxin6、C657聚類在一個分支上，可能是相似的品種，親緣關系最近，它們的菌絲生長速度基本一致，菌絲濃密，都有色素分泌，菌絲其他特征基本相似。從進化樹來看G1和G2親緣關系近，但是二者菌絲形態差異較大，主要體現在G1菌絲無色素分泌；C916、S16、zbxin的親緣關系較遠，三者的菌絲形態也是差異較大。

2.3 菌株拮抗關系結果分析

選取幾組具有代表性的拮抗結果進行分析，如圖3所示，具有親緣關系的菌株T261、L2611、L261-1與菌株S1、C657、Cxin6的菌絲兩兩之間無拮抗現象發生，說明三者之間親緣關系近，通過拮抗實驗觀察這一支上的木耳菌株之間均無拮抗現象發生，這與進化樹結果是一致的，同時與菌絲形態特性結果也是保持一致的。G2與CO2有很明顯的拮抗線，說明二者親緣關系較遠，這與進化樹結果一致，但是G1與G2之間也有較明顯的拮抗，這與進化樹結果不一致，菌絲形態結果也顯示二者差異較大，是由于黑木耳的形態和品質容易受時間、環境以及生理特性等因素的影響，使基于形態學試驗對黑木耳菌株進行分類研究的結果不夠準確[5]。菌株zbxin與C916、T16與zbxin拮抗線不明顯，說明二者親緣關系較近，進化樹顯示二者親緣關系較遠，而且菌絲形態差異也很大；C916與T16拮抗明顯，說明二者親緣關系較遠，菌絲形態差異也較大，這與進化樹結果一致。

圖3 木耳菌絲拮抗

3 結論與討論

通過將黑木耳菌株的形態特征、拮抗試驗以及ITS系統發育樹三者結合起來，綜合分析了秦巴山區13個黑木耳菌株的遺傳多樣性，這將給zbxin菌株進行栽培選育工作奠定了一定的基礎。劉華晶等采用ITS對采自黑龍江省的33株野生黑木耳資源和8個本省常見栽培木耳品種進行遺傳多樣性分析，結果發現黑龍江野生黑木耳遺傳位點豐富，黑木耳栽培菌株遺傳多樣性沒有野生菌株豐富[3]。錢雪婷等采用ITS方法對秦巴山區黑木耳菌株的親緣關系進行鑒定，結果表明：秦巴山區黑木耳菌株遺傳多樣性較為豐富，菌株親緣關系較近，有的幾乎沒有差異，可能是相互引種，為同一木耳品種[5]。

我們在實驗中發現菌株zbxin菌絲活力旺盛，吃料能力強，菌絲粗壯，將zbxin的ITS序列在NCBI數據庫GenBank中進行BLAST比對，下載序列同源性較高的15個黑木耳ITS序列，再用MEGA 6.0軟件中鄰接法模型構建出系統進化樹，zbxin 與ear fungus HQ388371.1、Auricularia sp.91 KJ679440.1和Auricularia heimuer voucher MG925224.1三個黑木耳菌株同源性最高，都達到了100%相似性，說明它們的同源性很高，親緣關系很近，而且在圖4中顯示它們在進化樹也為同一分支上，但并不能代表它們與供試菌株就是同一木耳菌株。Zbxin與菌株MG925224.1、JN712676.1遺傳距離較遠，親緣關系遠。KM583898.1、JN043322.1、HQ38872.1等7個為一支，它們遺傳距離最近，親緣關系近，但在進化樹上這些菌株與zbxin遺傳距離最遠，親緣關系最遠。zbxin ITS序列與剩余的13條ITS序列幾乎都達到了99.6%的相似性，說明雖然zbxin從秦巴山中采樣分離獲得，但是通過ITS方法鑒定其與其他木耳菌株親緣關系遠近，差異不是非常顯著，這表明我們目前收集到木耳品種雖然存在著一定的遺傳差異，但親緣關系較近，遺傳多樣性不豐富。因此我們可以擴大樣本搜集范圍，跨越到山西，山東，東北等木耳主產區，同時采用兩種以上的方法結合起來對采集的木耳菌株資源進行遺傳多樣性分析，這樣使得我們的研究結果覆蓋范圍更廣、更準確。

圖4 基于rDNA ITS堿基序列構建的NJ系統發育樹