乙肝藥物研發簡史，中國在這一領域逐漸扮演重要角色

黃宇翔

1981年，默沙東公司研發的一代乙肝疫苗Heptavax-B通過美國食品藥品管理局（FDA）審批上市。同一時期的中國，乙肝泛濫的情況要嚴峻許多。

北京醫科大學陶其敏醫生順著Heptavax-B的思路，于1975年7月1日研制出中國第一支血源性乙肝疫苗（這一疫苗根據誕生日期被命名為“7571”）。由于經費短缺無法支持在黑猩猩中開展動物實驗，1975年8月29日，陶其敏醫生挺身而出，勇敢地在自己身上注射“7571”疫苗——“7571”疫苗最終大獲成功。

但血源性疫苗價格昂貴，同時仍然有潛在的安全隱患。隨著重組蛋白革命的風潮在20世紀70年代末興起，乙肝疫苗研究者開始將希望寄托于分子生物學技術。與此同時，加州大學伯克利分校的蘭迪?謝克曼（Randy Schekman）教授發現蛋白分泌通路在單細胞生物面包酵母中高度保守。于是，在利用重組DNA技術開發新型HBV疫苗的跑道上，默沙東公司、百健公司和法國巴斯德研究所三個團隊展開了激烈的角逐，最終由默沙東公司拔得頭籌，開發的酵母重組蛋白疫苗Recombivax于1986年獲批上市。這便是第二代乙肝疫苗。

二代乙肝疫苗安全性更高，生產成本低廉，顯著加快了在乙肝疫苗人群中的普及速度。時任默沙東公司總裁的羅伊?瓦杰洛斯（Roy Vagelos）博士于1989年做出了一個偉大的決定，將默沙東公司的二代乙肝疫苗生產線以低廉的價格贈送給深受乙肝折磨的中國。

在疫苗強大力量的加持下，從20世紀90年代開始乙肝病毒的母嬰傳播被顯著阻斷：在短短20年的時間里，中國由母嬰傳播導致的乙肝病例下降了97%。

1989年9月11日，默沙東公司、中國技術進出口公司、北京生物制品研究所和深圳康泰生物制品公司簽訂了合同

但是抗擊乙肝的戰役還遠遠沒有結束，到了2015年中國依然有8 000萬左右的乙肝病毒感染者，其中包含2 280萬的育齡婦女。因此，盡管乙肝疫苗非常有效，中國在2015年左右依然每年有5萬名左右的嬰兒一出生就不幸感染了乙肝病毒。

這就促使南方醫科大學的侯金林醫生發起了“小貝殼”項目（Shield Project）。根據侯金林醫生的設想，通過“小貝殼”移動應用程序，全國的醫生可以實時監測乙肝病毒攜帶者在懷孕期間的病毒活躍水平，從而指導高傳染性媽媽們在懷孕期間服用抗病毒藥物，并且在寶寶剛出生時一邊通過被動免疫的方式注射抗體抵御乙肝病毒，另一方面及時注射疫苗幫助寶寶盡快建立起抵御乙肝病毒的“免疫軍隊”。截至2019年2月，全中國已經有124家醫院加入了“小貝殼”項目，對阻斷乙肝病毒母嬰傳播的保護率高達99.1%。

但對于目前全球范圍內約2.6億的乙肝感染者來說，打疫苗已為時過晚。乙肝病毒并不會立刻殺死自己的宿主細胞，但在慢性感染的狀態下，肝細胞一面承擔著高強度的代謝任務，一面承受著病毒寄生施加的壓力。在這種長期“內卷”的狀態下，肝功能的衰退在所難免進而引發肝病；而在這種“養蠱”環境下少數發生癌變的細胞由于更加適應惡劣的生存條件，最終的“蠱王”有可能促使肝癌發生。

幸運的是，經過幾代科學家的努力，盡管乙肝目前還很難被“治愈”，但在很大程度上可以得到有效控制。說到乙肝的治療，就不得不提抗病毒治療的“絕代雙驕”—— 干擾素和核苷類似物。

乙肝治療的絕代雙驕

在20世紀五六十年代，糖皮質激素類藥物曾被應用于治療肝炎，但人們逐漸意識到激素類藥物雖然在治療甲型肝炎中有一定作用，但在抗擊乙型肝炎的戰場上不僅毫無用武之地，反而對于病情有害。1981年，香港科學家林鉅津、黎青龍與法國合作者經過嚴謹的臨床試驗，正式為乙肝激素療法蓋棺定論。

1957年，病毒學家亞歷克?艾薩克斯（Alick Isaacs）和林登曼（Jean Lindenmann）發現了一種具有抗病毒效應的新型細胞因子，將其命名為“干擾素”。干擾素很快被視作“抗病毒的青霉素”，被人們寄予厚望。

1976年，美國國立衛生研究院的哈利?格林伯格（Harry Greenberg）等人首次在三名病情嚴重的慢性乙肝病人中嘗試腹腔注射從人血中純化出的干擾素。持續數月的干擾素治療取得了奇效：三位患者體內的乙肝病毒擴增都得到了抑制，三人血清中乙肝表面抗原HBsAg水平都顯著下降，其中有兩人更是呈現出從“大三陽”到“小三陽”的血清型轉換。可惜由于干擾素難以被批量生產，相關的臨床試驗被暫時擱置。

20世紀80年代中期，隨著干擾素基因被克隆，將干擾素應用于乙肝治療的興趣再次被點燃。

盡管嚴重的副作用（尤其是精神類疾病方面）始終伴隨著干擾素的使用，為期一年的干擾素注射治療能夠對20%~30%的慢性乙肝病人體內乙肝病毒形成有效打擊。盡管由于cccDNA的存在，干擾素治療并不能完全清除體內寄生的乙肝病毒，但經此一劫患者體內殘余的乙肝病毒也仿佛是被“嚇破了膽”，面對免疫系統的圍剿從此“杯弓蛇影”，不再能對肝器官形成實質性的威脅。1986年6月，FDA批準將干擾素α-2b應用于乙肝治療。

20世紀90年代，羅氏公司的科學家通過在重組干擾素蛋白上添加聚乙二醇修飾，極大地增加了重組干擾素在體內的穩定性，使得干擾素注射的頻率由原先的每天一次降低到每周一次，所需的療程也由52周縮減到了24周。但由于其較強的副作用，干擾素療法并不適用于所有人，尤其是處在圍產期的孕婦。那么在上文提到的“小貝殼”項目中，推薦乙肝感染孕婦口服的“抗病毒藥物”究竟是什么呢？

1989年，加拿大一家名為BioChem的生物技術公司吸引了埃默里大學化學家雷蒙德?斯辛納齊（Raymond Schinazi）的注意力。

埃默里大學化學家斯辛納齊

BioChem的科學家研發了一種用于抗擊HIV病毒的新型核苷類似物。斯辛納齊注意到BioChem這一新型的合成產物是包含了“左旋”分子和“右旋”分子的混合物。出于化學家的直覺，斯辛納齊猜測如果把這組對映異構體分離開，可能會得到更具生物學活性的化合物。他立刻與同事丹尼斯?利奧塔（Dennis Liotta）開展合作，嘗試分別純化出BioChem公司合成的混合物中的“左旋”分子和“右旋”分子。

對于核苷類似物，斯辛納齊心中有著深深的執念：在尋找新型癌癥化療藥物的探索過程中，他的博后導師威廉?普魯索夫（William Prusoff）合成了一種名為“碘苷”（Idoxuridine，IDU）的胸腺嘧啶核苷類似物。不久之后，美國國立衛生研究院的眼科醫生赫伯特?考夫曼（Herbert Kaufman）意外地發現這種失敗的抗癌藥物在治療由病毒感染導致的皰疹性角膜病變中效果驚人，從此核苷類似物正式登上了抗病毒治療的舞臺。

普魯索夫的博后弟子鄭永齊（Yung-Chi Cheng）在探究核苷類藥物抑制病毒機制時發現，以“碘苷”為代表的胸腺嘧啶核苷類似物大顯神威的關鍵，是它們可以被病毒的胸腺嘧啶激酶誤認作胸腺嘧啶，進而可以作為“搗亂分子”嵌入剛剛復制一半的病毒DNA，導致病毒DNA復制的意外中斷。

因此，當艾滋病在80年代 暴發之際，在研發抗擊HIV藥物的過程中，胸腺嘧啶核苷類似物被寄予厚望——這其中自然少不了斯辛納齊活躍的身影。

斯辛納齊驚喜地發現一種名為齊多夫定（Zidovudine，AZT）的胸腺嘧啶核苷類似物能有效抑制HIV病毒的逆轉錄酶活性，但在人體中毒性較大。當斯辛納齊還在謹慎地探索AZT的毒副作用時，競爭者大衛?巴里（David Barry）捷足先登，關于AZT作為抗艾藥物的申請于1987年3月得到FDA批準，從而奪走了“第一款艾滋藥物研發者”的榮光。

斯辛納齊很不甘心，立志要臥薪嘗膽研發出比AZT更加安全有效的抗艾新藥。而被他寄予厚望的新目標，并不是胸腺嘧啶核苷類似物，而是四種常見含氮堿基之外的異類：硫代胞苷類似物（簡稱3TC，又被稱為拉米夫定，Lamivudine）。斯辛納齊驚喜地發現拉米夫定優秀的抑制HIV病毒表現，最終如愿以償地在1995年將拉米夫定推向抗艾市場。

但與此同時，斯辛納齊的師兄鄭永齊還發現拉米夫定在細胞系中對于乙肝病毒的增殖也具有抑制效果，很快被推進到臨床——拉米夫定可以口服，副作用明顯低于干擾素注射，超過50%的病人在服用后病情得到緩解。最終，拉米夫定于1998年獲得FDA批準被用于慢性乙肝感染的治療。

但拉米夫定卻存在兩個巨大的缺陷：首先是耐藥性，在拉米夫定巨大的選擇壓力下，那些DNA聚合酶不會結合拉米夫定的乙肝病毒在患者體內迅速獲得巨大的生存優勢，進而導致耐藥性的產生——超過半數的乙肝患者在服藥三年內都會產生耐藥性；其次，拉米夫定只能抑制病毒的復制，而不能從根源上將乙肝病毒斬草除根。因此一旦停藥，蟄伏已久的乙肝病毒就會迅速卷土重來——終生的服藥需求為患者帶來了巨大的經濟負擔。

一位病毒學家、一位化學家和一位創業者組成的“黃金鐵三角”默契配合，聯手為克服第一個問題找到了近乎完美的解決方案。

病毒學家埃里克?德克勒克

在德國合作者弗里茨?愛克斯坦（Fritz Eckstein）的邀請下，比利時魯汶大學的病毒學家埃里克?德克勒克（Erik De Clercq）在1976年來到德國哥廷根參加一小群核酸化學家組織的會議。

德克勒克本來只想成為一名醫生，對于做研究并不感興趣。但就讀醫學院期間，在極富感染力的免疫學家皮特?德桑莫（Piet De Somer）再三建議下開始嘗試科研。德桑莫在研制脊髓灰質炎疫苗的過程中一戰成名，并且在干擾素被發現后迅速跟進，從而將德克勒克帶入了干擾素和抗病毒的領域。受到關于“核酸激發干擾素分泌”發現的影響，默沙東公司莫里斯?希勒曼（Maurice Hilleman）在斯坦福大學托馬斯?梅里根（Thomas Merigan）實驗室開展博后研究期間，系統性地研究不同類型的寡聚核酸分子（由德國化學家弗里茨?愛克斯坦提供）刺激干擾素分泌的效果。

安東尼恩?霍利

會議中一位特殊的演講者吸引了德克勒克：來自捷克斯洛伐克有機化學和生物化學研究所的安東尼恩?霍利（Anthonin Holy）癡迷于核酸化學，但工作的重要性并沒有得到單位同事們的注意。受困于窘迫的經費狀況，霍利買不到足夠用于研究核酸成分的酶——為此他在實驗室飼養毒蛇，從而能從蛇毒中純化實驗材料。

德克勒克主動找到霍利，為他慷慨提供所需的試劑。霍利也投桃報李，定期將自己新合成的核苷類似物寄給德克勒克進行抗病毒活性的測量。

不到一年的時間，兩人的合作就結出了豐碩的果實：他們發現核苷類似物DHPA是一種廣譜的抗病毒化合物，從此開啟了他們長達數十年的科學合作。

隨著艾滋病的 暴發在80年代成為環球同此涼熱的公共衛生問題，德克勒克和霍利也加入了抗艾藥物研發的大軍。1986年，他們在腺苷的結構基礎上合成了具有抑制HIV病毒復制功效的化合物PMEA。

可是，將一個藥物通過臨床試驗最終推向市場造福大眾，是一個需要大量人力物力投入的漫長過程。德克勒克和霍利都沒有這個能力。

企業家約翰?馬丁（John Martin）的加入至關重要。馬丁是化學科研出身，此時在百時美施貴寶公司領導抗病毒藥物的開發。馬丁很看好PMEA用于艾滋病治療的前景，主動聯系了德克勒克和霍利——三人相談甚歡，大有相見恨晚的感覺。當馬丁于1990年開始掌舵初創的生物技術公司吉利德時，也將這項合作帶到了新東家。

在后續的研究中，三人所領導的團隊發現PMEA較強的腎毒性令其在抗艾藥物開發的途中遺憾出局。但PMEA能在相對較低的劑量有效抑制乙肝病毒，使得三人組的注意力轉移到了乙肝藥物的開發上。

1992年，霍利發現只需要在PMEA的支鏈上額外添加一個甲基，所得的PMPA分子也能有效抑制乙肝病毒擴增。而PMPA還有更廣為人知的另一個名字：替諾福韋（Tenofovir）。

替諾福韋的水溶性較差，吉利德的科學家在它的側鏈添加了兩個富馬酸分子，得到水溶性更好的富馬酸替諾福韋酯（TDF）。

臨床3期結果表明，76%的“大三陽”感染者在服用TDF后病毒復制被抑制，93%的“小三陽”感染者服用TDF后有響應，同時三年內沒有觀察到一例耐藥性的產生。

2008年，用于慢性乙肝治療的TDF正式獲批，商品名“韋瑞德”（Viread）。

在TDF的基礎上，吉利德的科學家進一步優化了替諾福韋側鏈上的基團，發現當把富馬酸替換為艾拉酰胺時，整個分子不僅在血液中更加穩定了，而且還能被肝細胞主動吸收，從而極大降低了需要口服的劑量——這一分子學名叫做“替諾福韋艾拉酚胺”（TAF）。

2016年，TAF的臨床3期結果公布，藥效與TDF相似，但低劑量用藥為患者們帶來了一個福音：腎毒性顯著降低了——2016年底，TAF正式獲批上市，商品名“韋立德”（Vemlidy）。

除此之外，百時美施貴寶開發的恩替卡韋（Entecavir）、Idenix制藥公司（2014年被默沙東公司收購）開發的替比夫定（Telbivudine）作為可以抑制乙肝病毒逆轉錄過程的核苷類藥物紛紛加入了抗擊乙肝的戰斗中。

遺憾的是，盡管抗擊乙肝的武器庫中有這么多琳瑯滿目的藥物，我們目前還只能做到阻止乙肝病毒的復制，無法將其完全清除。絕大多數的患者肝細胞表面依然可以檢測到乙肝表明抗原HBsAg。進一步開發新型藥物，還需要對于乙肝病毒的特性取得更加深刻的認識。

值得注意的是，相比于歐美國家，中國的乙肝患者數目更多，更加急切地盼望能根治乙肝病毒的新藥。隨著中國生命科學基礎科研水平的飛速增長，中國的乙肝研究也開始騰飛。近些年來，中國科學家在乙肝基礎研究領域做出了兩項創新性研究。

揭曉乙肝病毒侵染肝細胞的謎題

乙肝病毒是如何感染宿主細胞的？人體中有各種各樣的細胞類型，為什么乙肝病毒偏偏選擇把感染擴增的“基地”選擇在肝細胞？在乙肝病毒被鑒定后的將近50年時間里，這個問題始終是一個乙肝研究的黑洞。

人們推測乙肝病毒侵染的細胞特異性來源于乙肝病毒表面抗原與人體肝細胞表面特定的“受體蛋白”的結合，但這個假想的“受體蛋白”究竟是什么卻一直是一個謎團。這背后的一大原因在于，乙肝病毒體外研究在技術上是非常困難的。

在鑒定出“澳抗”后不久，巴魯克?布隆伯格（Baruch Blumberg）團隊的斯科特?馬祖爾（Scott Mazzur）就試圖在體外擴增乙肝病毒，但屢次嘗試都以失敗告終。

原來，乙肝病毒雖然在體內詭計多端，橫行霸道，可一旦被安置在體外環境下培養就立刻變得非常嬌貴，只能侵染剛剛被分離出的原代肝細胞——而且同一批肝細胞分裂幾次，細胞膜表面的“受體蛋白”仿佛就神秘消失了。缺少了這個“里應外合”的關鍵幫手，乙肝病毒面對自己欺負慣了的肝細胞一下子便無可奈何。

乙肝病毒在體外的拉胯表現可苦了希望深入了解乙肝病毒侵染機制的研究者們。1987年，紐約大學的喬治?阿奇（George Acs）團隊費盡氣力終于研制出了一種能夠讓乙肝病毒實現擴增的細胞系：既然乙肝病毒無法自己攻克傳代肝細胞系細胞膜構成的“堡壘”，研究者干脆將乙肝病毒DNA轉入HepG2肝癌細胞系中。一旦進了細胞內部，乙肝病毒DNA就能迅速占領細胞核，合成出成千上萬的病毒顆粒。鄭永齊與斯辛納齊有關拉米夫定對乙肝病毒增殖效果的研究，就是借助了阿奇團隊開發的這一細胞系。但這一系統的原理決定了它并不能幫助研究者尋找肝細胞特有的乙肝病毒受體蛋白。

北京生命科學研究所研究員李文輝

2007年，在北京生命科學研究所（NIBS）建立起獨立實驗室的李文輝，向這一科學難題發起了挑戰。

要想找到乙肝病毒受體，首先得有個乙肝病毒能侵染的細胞模型。2002年法國科學家通過對一份肝癌病人的凍存細胞進行誘導分化，獲得了能被乙肝病毒穩定侵染的肝細胞系HepaRG。因此，如果李文輝能培養出大量的HepaRG細胞系，就有可能從中純化出神秘的“乙肝病毒受體”。可是，HepaRG細胞系的誘導分化過程比較麻煩，所需要的時間也比較長，使用起來遠不如常用的細胞系方便。那有沒有可能從實驗動物的肝細胞中找到合適的模型呢？

奇怪的是，乙肝病毒仿佛就是為人體細胞“量身定制”似的，除了黑猩猩以外在其他靈長類動物中都無法引發肝炎癥狀，對于小鼠這樣的小型動物更是鞭長莫及。

中國科學家在20世紀80年代發現一種與靈長類親緣關系較近的小型動物樹鼩（Tupaiabelangeri）的肝細胞能被乙肝病毒感染。盡管只會引起輕微的肝炎癥狀，但這說明樹鼩的肝細胞表面存在乙肝病毒受體。1996年，德國的研究者在此基礎上更進一步，發現體外培養的樹鼩肝細胞不會像人類肝細胞一樣輕易失去乙肝病毒受體，能夠穩定地被乙肝病毒侵染。因此，李文輝將希望寄托在了樹鼩肝細胞上。

同時，基于一段已知會與肝細胞表面結合的乙肝表明抗原片段，李文輝團隊通過把其中的兩個氨基酸替換為亮氨酸類似物（L-Photo-Leucine）將這一抗原片段改造為一個分子探針。當受到紫外光線照射時，這一分子探針上的亮氨酸類似物能與附近的蛋白質形成共價鍵連接。李文輝團隊將探針從樹鼩肝細胞中純化出來，通過質譜學方法檢測探針上連接的蛋白質，最終鑒定出了肝細胞表面被乙肝病毒“買通”的內應——鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白（NTCP）。

在體外細胞中異源表達NTCP蛋白，就為乙肝病毒的侵染打開了大門——從此研究者們再也不用為缺少乙肝病毒感染模型發愁了。

同時，研究者也將NTCP蛋白作為靶點，設計能抑制乙肝病毒侵染肝細胞的新型乙肝藥物。目前，由德國生物技術公司MYR（于2020年12月被吉利德以11.5億歐元的價格收購）開發的NTCP抑制劑Hepcludex已經于2020年7月在歐洲被批準上市，進一步豐富了人類抗擊乙肝的武器庫。

憑借鑒定乙肝受體蛋白NTCP的貢獻，李文輝博士榮獲2021年度乙肝研究領域的最高獎項——巴魯克?布隆伯格獎。李文輝團隊也在積極推進NTCP抑制劑的臨床試驗，未來我們也許將會看到國產NTCP抑制劑的問世。

外泌體：乙肝病毒侵染的秘密武器

免疫系統與乙肝病毒的斗爭是一場持久戰。在慢性乙肝病毒感染長期的消耗過程中，人體的天然免疫系統和適應性免疫系統都會陷入疲勞，無力對抗聲勢浩大的乙肝病毒。

而干擾素治療之所以有效，我們可以想象成是為人體免疫系統空降了一群生力軍，它們不僅能立刻投入戰斗，還可以動員已經偃旗息鼓的免疫軍隊重新振作起來。但干擾素治療并不總是所向披靡，只能給一部分病人帶來病癥上的緩解。這主要是由于乙肝病毒能夠千方百計地阻撓免疫系統抵抗病毒的作戰能力。比如復旦大學醫學院的袁正宏團隊就發現，血液中的乙肝病毒在被巨噬細胞吞食之后，能憑借表面抗原HBsAg干擾巨噬細胞的JNK信號通路，摧毀巨噬細胞的持續作戰能力。再比如說，袁正宏團隊還發現，乙肝病毒的DNA聚合酶可以抑制肝細胞感受外源DNA物質入侵的cGAS-STING通路，阻斷受感染的肝細胞向免疫系統發出求救信號。

復旦大學醫學院袁正宏教授

不過，在正面戰場受到乙肝病毒壓制的不利情況下，在肝器官的“病毒占領區”，還有一群令人意想不到的“敵后武裝力量”，默默地支持著對抗乙肝感染的艱苦斗爭，從而換來了干擾素治療30%~40%的響應率。

袁正宏團隊發現，在人體的肝器官中，有1/3的細胞屬于肝非實質細胞（LNPC）。LNPC沒有承擔繁重的代謝任務，表面也不表達NTCP蛋白，因此不會受到乙肝病毒猛烈進攻。但身處病毒感染陰云籠罩的肝器官，LNPC并沒有置身事外——在干擾素的刺激下，LNPC的細胞工廠被動員起來，大量合成抗病毒分子，再通過一種被稱作“外泌體”（exosome）的囊泡將寶貴的“抗病毒補給物資”輸送到水深火熱的肝實質細胞中。這一發現豐富了人們對干擾素作用機制的認識：原來干擾素不僅能在正面戰場抗擊乙肝，還能夠深入敵后，通過將抗病毒分子包裝在外泌體中支持肝細胞的抗病毒斗爭。