西紅花酸對阿霉素誘導大鼠心肌細胞損傷的影響

韓笑，王攀，劉建勛，陶夏莉，任鈞國，付建華，許勇剛

西紅花酸對阿霉素誘導大鼠心肌細胞損傷的影響

韓笑1，王攀1，劉建勛1，陶夏莉2，任鈞國1，付建華1，許勇剛1

1.中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，北京市中藥藥理重點實驗室，北京 100091； 2.北京瑞諾眾德科技有限公司，北京 100089

觀察西紅花酸對阿霉素誘導的大鼠心肌細胞損傷的影響，從線粒體角度探討其作用機制。培養H9c2大鼠心肌細胞，阿霉素誘導建立心肌細胞損傷模型。細胞分為正常組、模型組（阿霉素10 μmol/L）、西紅花酸高劑量組（阿霉素10 μmol/L＋西紅花酸20 μmol/L）、西紅花酸低劑量組（阿霉素10 μmol/L＋西紅花酸10 μmol/L），給藥6 h后CCK-8法檢測細胞存活率，DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧（ROS）水平，JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達，免疫熒光檢測Caspase-8蛋白表達。與正常組比較，模型組H9c2細胞存活率降低（＜0.01），細胞內ROS水平升高（＜0.001），線粒體膜電位降低（＜0.001），細胞凋亡率升高（＜0.001），cleaved Caspase-3蛋白表達升高，cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低（＜0.001），Caspase-8蛋白表達明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞存活率顯著升高（＜0.01，＜0.05），ROS水平顯著降低（＜0.001），線粒體膜電位升高（＜0.001），細胞凋亡率降低（＜0.01），cleaved Caspase-3蛋白表達降低，cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值降低（＜0.001，＜0.05），Caspase-8蛋白表達顯著降低（＜0.001），西紅花酸高劑量組Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高（＜0.01）。西紅花酸可保護阿霉素致心肌細胞損傷，其機制可能與保護線粒體、抑制細胞凋亡相關。

西紅花酸；阿霉素；線粒體；凋亡；心肌細胞；大鼠

阿霉素是臨床廣泛使用的抗癌抗生素，但其毒副作用使腫瘤患者心臟病的發病率和病死率增加，嚴重影響其生活質量和遠期存活[1]。氧自由基的生成和線粒體氧化應激損傷是阿霉素導致心臟毒性的關鍵病理環節[2-3]，細胞凋亡在阿霉素心肌病的發病過程中也起到關鍵作用[4]。西紅花苷片臨床用于治療心血管疾病。由于西紅花苷相對分子質量大，極性強，口服不能以原型藥物透過腸道屏障，需經腸道酶或細菌酶作用，水解成苷元西紅花酸后方可吸收入血。西紅花酸可能是西紅花苷的體內活性分子[5-7]。目前西紅花酸在保護阿霉素致心肌損傷方面研究較少，致使西紅花苷片（西紅花酸）治療或輔助治療阿霉素心肌病缺乏有效的證據支持。因此，本研究采用阿霉素誘導建立大鼠心肌細胞損傷模型，從保護線粒體、抑制凋亡角度探討西紅花苷體內活性成分西紅花酸對阿霉素致心肌細胞損傷的保護作用及相關機制。

1 實驗材料

1.1 細胞和藥物

H9c2大鼠心肌細胞株，中國科學院上海細胞庫；注射用阿霉素，10 mg/支，批號1905E1，深圳萬樂藥業有限公司；西紅花酸，純度98.0%，貨號27876-94-4，美國MCE；注射用右丙亞胺，250 mg/支，批號E2005012，江蘇奧賽康藥業有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基（美國Gibco，批號8120234），胎牛血清（美國Gibco，批號2039230），胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，批號20191220），PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號20200903），CCK-8試劑盒（日本Dojindo，批號SA618），Quick Start Bovine Serum Albumin Standard（美國Bio-Rad，貨號500-0206），活性氧檢測試劑盒（上海碧云天，貨號041720200803），線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天，貨號C2006），YF?488 Click-iT EdU Flow Cytometry Assay Kits（蘇州宇恒，貨號Y600），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，批號034A3300），10×電泳緩沖液（北京華興博創基因技術有限公司，貨號HX1896），10×封閉洗滌液（北京華興博創基因技術有限公司，貨號HX1893），增強型化學發光檢測試劑（美國Thermo Scientific，貨號34096），兔抗Caspase-3抗體（英國Abcam，貨號ab13847），兔抗Bax抗體（英國Abcam，貨號ab32503），兔抗Bcl-2抗體（英國Abcam，貨號ab194583），兔抗Caspase-8抗體（英國Abcam，貨號ab25901），兔抗β-actin抗體（美國Affinity Biosciences，貨號AF7018），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京源博匯科生物技術研究所，批號127760），Hoechst33342染色液（北京索萊寶，批號20190509），FITC標記羊抗兔IgG（北京源博匯科生物技術研究所，批號138768）。生物安全柜（蘇凈集團安泰公司，BHC-1300ⅡA/B3），CO2培養箱（美國Thermo，371），倒置顯微鏡（日本Olympus，IX51），熒光顯微鏡（日本Olympus，IX81），多功能酶標儀（美國BioTek，Synergy 4），冷凍高速離心機（美國Thermo，IEC CL31R），電泳儀（美國Bio-Rad，Power Pac Univeral），凝膠成像儀（美國Bio-Rad，ChemiDoc XRS+）。

2 實驗方法

2.1 心肌細胞培養

液氮中快速取出H9c2細胞，37 ℃水浴中迅速融化，將細胞液轉移至離心管，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細胞沉淀以5 mL培養基重懸，轉移至培養瓶中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后換液，待細胞融合達85%時，胰蛋白酶消化傳代。細胞穩定2～3代后，取對數生長期細胞用于后續實驗。

2.2 分組及給藥

將H9c2細胞分為正常組、模型組、西紅花酸高劑量組、西紅花酸低劑量組。模型組H9c2細胞用含10 μmol/L阿霉素的DMEM培養基處理6 h，西紅花酸高劑量組用含10 μmol/L阿霉素和20 μmol/L西紅花酸的DMEM培養基處理6 h，西紅花酸低劑量組用含10 μmol/L阿霉素和10 μmol/L西紅花酸的DMEM培養基處理6 h，正常組用DMEM培養基培養6 h，6 h后取細胞進行后續檢測。

2.3 細胞存活率檢測

取生長于96孔細胞培養板中的細胞，按各組給藥方案處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育3 h，酶標儀波長450 nm處測定各孔吸光度（OD），計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝實驗組OD值÷正常組OD值×100%。

2.4 活性氧水平檢測

取生長于共聚焦培養皿的H9c2細胞，按各組給藥方案處理后，采用DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧（ROS）水平。嚴格按試劑盒說明書操作，無血清培養基清洗細胞1次，加入1 mL無血清培養基稀釋的DCFH-DA ROS探針（1∶1 000），放回培養箱孵育20 min，無血清培養基清洗細胞3次，去除多余的ROS探針，加入1 mL無血清培養基，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組3個樣本，每個樣本隨機選取5個視野拍照，Image J軟件分析ROS平均熒光強度。

2.5 線粒體膜電位檢測

取接種于共聚焦培養皿的H9c2細胞，按各組給藥方案處理后，采用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位。嚴格按試劑盒說明書操作，吸棄舊培養基，PBS洗滌1次，加入1 mL細胞培養基和1 mL JC-1染色工作液，混勻后放回培養箱孵育20 min，吸除上清液，以JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL細胞培養基，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光和綠色熒光，每組3個樣本，每個樣本隨機選取5個視野拍照，Image J軟件分析紅綠熒光強度，以紅綠熒光比值表示線粒體膜電位。

2.6 細胞凋亡率檢測

取生長于培養瓶中的H9c2細胞，經分組給藥方案處理后，流式細胞術檢測細胞凋亡率。胰蛋白酶消化細胞，4 ℃、300×離心5 min，收集5×105個細胞，用100 μL結合緩沖液重懸，將細胞懸液轉移至測定管，每管加入4 μL YF?488-Annexin V和4 μL PI工作液，室溫避光孵育15 min，每管加入400 μL PBS，流式細胞儀檢測。

2.7 Western blot檢測

取生長于培養瓶中的H9c2細胞，按分組給藥方案處理后，預冷PBS洗滌3次，RIPA裂解液裂解30 min，離心取上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度；取等量蛋白上樣，經SDS-PAGE后，將蛋白轉膜至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，加入Caspase-3、Bcl-2、Bax（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶50 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，增強型化學發光檢測試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像儀顯影，系統成像軟件進行蛋白條帶灰度分析。

2.8 免疫熒光檢測

取生長于共聚焦培養皿的H9c2細胞，按分組給藥方案處理后，吸除舊培養基，PBS洗滌2次，預冷的4%多聚甲醛冰上固定細胞15 min，PBS洗滌3次，每次1 min；0.1%Triton X-100處理細胞10 min，PBS清洗3次，每次1 min；山羊血清室溫封閉1 h，加入Caspase-8（1∶50）抗體，4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次，每次3 min；加入FITC標記羊抗兔IgG（1∶200）室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次3 min；Hoechst33342染色液室溫孵育3 min，PBS清洗3次，每次1 min；加1 mL PBS，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組3個樣本，每個樣本隨機選取5個視野拍照，Image J軟件分析平均熒光強度。

3 統計學方法

4 結果

4.1 西紅花酸對模型細胞存活率的影響

與正常組比較，模型組H9c2細胞存活率明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞存活率明顯升高（＜0.01，＜0.05），西紅花酸高、低劑量組細胞存活率差異無統計學意義（＞0.05），見表1。

表1 各組H9c2細胞存活率比較（±s）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

4.2 西紅花酸對模型細胞活性氧水平的影響

與正常組比較，模型組H9c2細胞ROS水平明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞ROS水平明顯降低（＜0.001）；西紅花酸高劑量組ROS水平顯著低于西紅花酸低劑量組（＜0.001）。見圖1。

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001；與西紅花酸低劑量組比較，▲▲▲P＜0.001

4.3 西紅花酸對模型細胞線粒體膜電位的影響

正常組H9c2細胞JC-1以聚合物形式存在于線粒體中，呈紅色熒光，綠色熒光微弱，紅綠熒光比值較高，提示線粒體膜電位較高；模型組H9c2細胞JC-1以單體形式散在于胞漿中，呈綠色熒光，紅色熒光強度降低。與正常組比較，模型組H9c2細胞線粒體膜電位明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞線粒體膜電位有所升高（＜0.001），其中，西紅花酸高劑量組線粒體膜電位明顯高于西紅花酸低劑量組（＜0.001），見圖2。

4.4 西紅花酸對模型細胞凋亡率的影響

與正常組比較，模型組H9c2細胞凋亡率明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞凋率顯著降低（＜0.01），西紅花酸高、低劑量組細胞凋亡率差異無統計學意義（＞0.05）。見圖3。

4.5 西紅花酸對模型細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組H9c2細胞cleaved Caspase-3蛋白表達升高，cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值明顯降低（＜0.001，＜0.05），Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，其中，西紅花酸高劑量組Bcl-2/Bax比值升高，差異有統計學意義（＜0.01）。西紅花酸高劑量組作用優于西紅花酸低劑量組（＜0.05），見圖4、圖5。

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，**P＜0.01

注：A.正常組；B.模型組；C.西紅花酸高劑量組；D.西紅花酸低劑量組

注：與正常組比較，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與西紅花酸低劑量組比較，▲P＜0.05

4.6 西紅花酸對模型細胞Caspase-8蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組H9c2細胞Caspase-8蛋白表達顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細胞Caspase-8蛋白表達顯著降低（＜0.001）。見圖6、圖7。

圖6 各組H9c2細胞Caspase-8蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001；與西紅花酸低劑量組比較，▲▲▲P＜0.001

5 討論

西紅花具有活血化瘀、通脈止痛功效，臨床主要用于冠心病心絞痛心血瘀阻證的治療。藥理研究表明，西紅花苷具有降血壓[8]、降血脂[9]、抗動脈粥樣硬化[10]、抗心肌缺血[11]、抗心肌缺血再灌注損傷[12]、抗血小板聚集[13]等作用；此外，其有抗腫瘤活性[14]，能抑制多種惡性和非惡性腫瘤細胞的惡性增殖[15]。

化療藥物以阿霉素類藥品對心肌破壞最為顯著，對心肌器質性損害從第一次應用就可能出現[16]，并呈進行性加重，且不可逆轉[17]。西紅花苷是否可用于治療或輔助治療阿霉素心肌病，成為有效改善阿霉素心臟毒性的藥物，尚需更多體內外實驗的支持。

由于口服西紅花苷需水解成西紅花酸后才能吸收進入血液循環而發揮藥理作用[5]。因此，本實驗以西紅花酸為研究對象，觀察其對阿霉素致心肌細胞損傷的保護作用，并初步探討其作用機制。

心肌細胞富含線粒體，阿霉素對心磷脂具有較高的親和力，可進入線粒體，結合心磷脂從而抑制呼吸鏈，造成心臟損傷[18]。此外，線粒體是ROS產生的主要場所，同時也是ROS作用最敏感的靶點部位，ROS通化氧化線粒體心磷脂、線粒體DNA和線粒體重要的蛋白質對線粒體造成氧化損傷，導致線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位降低，ATP生成不足及細胞色素C等促凋亡因子過量釋放，進而激活Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。與此同時，受損的線粒體又可產生更多的ROS。ROS與線粒體氧化損傷互為因果，惡性循環，共同參與誘導細胞凋亡[19]。

Bcl-2和Bax是凋亡的重要調控基因，其中Bax是促凋亡基因，在死亡信號刺激下轉位至線粒體膜上，致使線粒體通透性轉運孔道開放，導致線粒體膜電位降低，釋放細胞色素C等促凋亡因子[20]，進而啟動Caspase級聯反應，其中啟動型Caspase-8首先被活化，啟動凋亡并調節效應型Caspase-3，分解細胞蛋白，執行凋亡[21]。Bcl-2是抑凋亡基因，超表達的Bcl-2蛋白可與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的轉位及二聚體化，關閉線粒體通透性轉運孔道，抑制Caspase級聯反應，從而抑制凋亡發生[20]?？梢?，Bcl-2/Bax比值決定細胞凋亡發生與否[22]。Bcl-2/Bax比值下降，預示線粒體通透性增加，線粒體膜電位降低，大量促凋亡因子釋放，活化Caspase-8進而啟動Caspase-3，細胞趨于凋亡；反之，Bcl-2/Bax比值增加，細胞趨于存活。

本實驗結果表明，阿霉素處理后，H9c2細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示阿霉素可誘導體外培養的心肌細胞凋亡，損傷心肌細胞。給予高、低劑量西紅花酸處理后，H9c2細胞ROS水平降低，線粒體膜電位升高，Bcl-2/Bax比值升高，Caspase-8表達降低，Caspase-3活化降低（cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值降低），細胞凋亡率降低，細胞存活率升高。提示西紅花酸可保護線粒體結構，一方面通過抑制受損線粒體產生過多的ROS，減輕ROS對線粒體的氧化損傷和結構破壞；另一方面通過調控Bcl-2和Bax蛋白表達，維持Bcl-2/Bax平衡，二者共同保護和維持線粒體結構，降低線粒體通透性，維持線粒體膜電位，抑制促凋亡因子過量釋放，從而減少或抑制啟動型Caspase-8的活化，進而減少Caspase-8對主要靶點pro-Caspase-3的活化剪切，抑制凋亡的發生，保護受損心肌細胞，最終體現為細胞凋亡率降低和細胞存活率升高。

綜上所述，西紅花酸對阿霉素所致心肌細胞損傷具有明顯的保護作用，其機制與保護線粒體、抑制細胞凋亡相關。

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Effects of Crocetin on Adriamycin-induced Cardiomyocyte Injury in Rats

HAN Xiao1, WANG Pan1, LIU Jianxun1, TAO Xiali2, REN Junguo1, FU Jianhua1, XU Yonggang1

To observe the effects of crocetin on adriamycin-induced cardiomyocyte injury in rats; To discuss its mechanism from the perspective of mitochondria.H9c2 (rat cardiomyocytes) were cultured and stimulated by adriamycin to make cardiomyocyte damage. The experiment was divided into normal group, model group (adriamycin 10 μmol/L), crocetin high-dosage group (adriamycin 10 μmol/L + crocetin 20 μmol/L), and crocetin low-dosage group (adriamycin 10 μmol/L + crocetin 10 μmol/L). After 6 hours of treatment, CCK-8 method was used to detect the cell survival rate; DCFH-DA was used to detect intracelluar ROS level; JC-1 fluorescent probe was used to detect mitochondrial membrane potential; flow cytometry was used to detect apoptosis rate; Western blot was used to detect the protein expressions of Caspase-3, Bcl-2 and Bax; immunofluorescence was used to detect the expression of Caspase-8.Compared with the normal group, the survival rate of the model group decreased (<0.01), the level of intracelluar ROS increased (<0.001), the mitochondrial membrane potential decreased (<0.001), the apoptosis rate increased (<0.001), the expressions of cleaved Caspase-3 and cleaved Caspase-3/pro Caspase-3 increased (<0.01), the expression of Bcl-2 decreased, the expression of Bax increased, the ratio of Bcl-2/Bax decreased significantly (<0.001), and the expression of Caspase-8 increased (<0.001). Compared with the model group, crocetin high- and low-dosage groups significantly increased cell survival rate (<0.01,<0.05), decreased intracellular ROS level (<0.001), increased mitochondrial membrane potential (<0.001), and decreased apoptosis rate (<0.01). The protein expression of cleaved Caspase-3 decreased and cleaved Caspase-3/pro Caspase-3 significantly decreased (<0.001,<0.05), and Caspase-8 protein expression was significantly reduced (<0.001). The expressions of Bcl-2 increased and Bax decreased in crocetin high-dosage group, and the ratio of Bcl-2/Bax significantly increased (<0.01).Crocetin can protect adriamycin-induced cardiomyocyte injury, and its mechanism may be related to the protection of mitochondria and inhibition of cell apoptosis.

crocetin; adriamycin; mitochondrion; apoptosis; cardiomyocyte; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0064-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202102347

國家科技重大專項－重大新藥創制（2017ZX09301018）

任鈞國，E-mail：reek2003@yahoo.com.cn

（收稿日期：2021-02-25）

（修回日期：2021-03-29；編輯：華強）