貯藏時間及繅絲工藝對桑蠶蛹蛋白質和脂肪酸組成及蛹油體外抗氧化活性的影響

吳寶祥，梁舒韻，朱立宏，江虹銳，劉小玲，姜 毅

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004）

蠶發育包括卵、幼蟲、蠶蛹及蠶蛾4 個階段，桑蠶蛹是鱗翅目蠶蛾科家蠶（Bombyx moriL.）的蛹，當五齡幼蟲進入熟蠶階段后停止進食，熟蠶吐絲結繭后變態成蛹，該過程中，蠶貯藏了豐富的營養物質以供蛹期發育[1-2]。我國年產桑繭約65萬 t，占世界總產繭量的70%以上，鮮蠶蛹年產量約50萬 t，是蠶業加工主要副產品之一[3]，通常被當成廢棄物或作為價格低廉的飼料[4]。2004年，蠶蛹被我國衛生部批準列入“作為普通食品管理的食品新資源名單”，其在食品工業上的開發應用逐漸受到人們的重視[5-6]。蠶蛹油脂中的α-亞麻酸和蛋白質含量豐富，氨基酸評分符合聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織推薦的標準蛋白模式值。近年來，我國鮮繭繅絲的蠶蛹主要以食品級蠶蛹形式出口日本、韓國，僅少數研究報道了將蠶蛹開發為蠶蛹罐頭[7]、蠶蛹蛋白飲料[8]，以及將蠶蛹粉添加至面食中提升面食的營養度[9]或作為高能量餅干的蛋白質來源[10]。

蛋白質、脂肪酸的生物活性對于開發蠶蛹功能性食品的價值有重要影響。Long Xingyao等[11]發現蠶蛹油對于鹽酸/乙醇誘導的胃潰瘍小鼠具有一定的保護作用。Hu Bin等[12]發現桑蠶蛹油的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率與蛹油中的總酚含量有關。Felix等[13]通過鐵離子還原能力法分析發現蠶蛹蛋白濃縮物在pH 8.0時具有較高的抗氧化活性。目前，為提高蠶絲的品質和蠶蛹的附加值，工業化的繅絲工藝已逐漸由傳統的干繭繅絲改進為鮮繭繅絲。由于收繭具有季節性和批量大的特點，工廠將鮮繭收集后，需經歷選繭、煮繭、繅絲等加工程序，而關于收繭繅絲過程中繭的貯藏時間、繅絲煮繭工藝對蛹蟲的營養價值及活性還鮮見報道。

本研究通過采集不同貯藏時間的桑蠶蛹和鮮繭繅絲后桑蠶蛹，分析貯藏時間和繅絲工藝對蛹的基本化學成分、脂肪酸組成、蛋白質組成等的影響；并探討桑蠶蛹油的體外抗氧化活性。通過對比貯藏期桑蠶蛹與繅絲鮮蛹之間的營養組成的變化、蛹油體外抗氧化活性的差異，為桑蠶蛹功能活性產品工業的樣品采集提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘兩廣二號’桑蠶繭 廣西宜州茂源繭絲有限公司；繅絲蠶蛹 廣西壯歌絲綢有限公司。

DPPH、14%（質量分數）三氟化硼-甲醇溶液上海麥克林生化科技有限公司；α-生育酚、磷酸鹽緩沖液（0.15 mol/L、pH 7.0）、Folin-Ciocalteu試劑 北京索萊寶公司；BCA試劑盒 上海碧云天生物技術公司；2,2’-聯氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、正己烷（色譜級）、沒食子酸標準品 美國Sigma公司；正己烷、無水乙醇、甲醇、硫酸銨、無水碳酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、過硫酸鉀均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

7890B/5977A氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國安捷倫公司；CR21N高速冷凍離心機 日本Hitach公司；Infinite M200 PRO光柵型多功能微孔板檢測儀 瑞士Tecan公司；UV1102II紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra Cell電泳槽、CHEMIDOC XRS凝膠成像系統美國伯樂公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器公司；SH220F石墨消解儀、K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器公司；SZF-06A粗脂肪測定儀上海新嘉電子有限公司；SX2-10-13箱式電阻爐 上海實研電爐有限公司；RE-201D旋轉蒸發儀、N100氮吹儀上海精密儀器儀表有限公司；EMS-40數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州愛華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑蠶蛹樣品的采集與形態觀察

取結繭6 d的蠶繭置于通風條件良好的貯藏室中，于（22±1）℃的條件下避光貯藏。每天定時隨機采集繭樣品20 只，記錄質量后破繭取蛹，對蠶蛹樣品進行形態觀察并記錄質量及體長。樣品按照蠶蛹發育過程中歷經復眼未著色、復眼著黑色、觸角著色以及體軟皮皺呈土色4 個主要形態變化[14]分為不同貯藏階段，并記錄為階段I、階段II、階段III和階段IV。為減少組內樣品間差異，采集時剔除死蛹以及與同時期蛹發育有顯著差異的樣品。將采集到的鮮繭蠶蛹、繅絲后的蠶蛹樣品于－20 ℃冰箱保存，一周內完成分析。

1.3.2 基本化學成分分析

蛋白質量分數依據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[15]中凱氏定氮法進行檢測；脂肪質量分數依據GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[16]中索氏抽提法進行檢測；灰分質量分數依據GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[17]中第一法食品中總灰分的測定進行檢測。

1.3.3 蠶蛹蛋白質的提取

將采集到的貯藏階段蠶蛹、繅絲蠶蛹經蒸餾水沖洗3 遍后，參考Chen Jianqing等[18]的方法稍作修改提取蛋白。取適量蠶蛹按質量體積比1∶1加入預冷的磷酸鹽緩沖液于4 ℃下以10 000 r/min均質至無明顯大顆粒。勻漿液經8 層紗布過濾蛹殼，濾液于4 ℃、12 000 r/min下離心30 min，棄去油脂層，收集上清液，重復離心兩次，將合并收集的上清液加入硫酸銨至硫酸銨飽和度為70%，4 ℃靜置2 h后，經5 000 r/min離心20 min，收集蛋白質沉淀。將硫酸銨沉淀得到的蛋白質復溶于磷酸鹽緩沖液，經7 000 Da透析膜透析脫鹽，經冷凍干燥后于4 ℃密封保存。樣品的蛋白質量濃度使用BCA法[19]進行測定。

1.3.4 蠶蛹油的提取

將1.3.1節中采集到的各貯藏階段蠶蛹及繅絲蠶蛹經冷凍干燥后粉碎，經100 目過篩后，于4 ℃下密封貯存備用。蠶蛹油的提取參照魏兆軍等[20]的方法并稍作修改，將蠶蛹與正己烷以質量體積比1∶8混合，經38 ℃恒溫水浴攪拌2 h后，將混合液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清；沉淀以相同條件再次提取上清液，合并兩次提取獲得的上清液。使用氮吹儀將上清液中有機溶劑去除，獲得蠶蛹油，于4 ℃密封貯存。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將1.3.3節獲得的蛋白質樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），采用質量分數5%濃縮膠和12%分離膠檢測蛋白質分子質量分布，電泳條件：樣品上樣量10 μL，樣品蛋白質量濃度為2 mg/mL，溴酚藍指示條帶位于濃縮膠時電壓為80 V，待指示條帶遷移至分離膠時電壓調整至120 V。經考馬斯亮藍R250染色液染色30 min，使用脫色液脫色至背景清晰后使用凝膠成像儀拍照，使用Image Lab軟件分析蛋白質分子質量。

1.3.6 蠶蛹油脂肪酸含量的測定

1.3.6.1 蠶蛹油的甲酯化

蠶蛹油的甲酯化參照路萍等[21]的方法。將3 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液加入0.10 g的蠶蛹油，于60 ℃水浴30 min后冷卻。將冷卻后的溶液加入14%三氟化硼-甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴5 min，流動水冷卻后再加入正己烷2 mL、飽和NaCl溶液2 mL，取上層溶劑層，加入無水Na2SO4脫水后，使用0.22 μm有機相針頭過濾器過濾甲酯化蠶蛹油至樣品瓶中，待測。

1.3.6.2 GC-MS分析條件

GC條件：使用DB-Wax毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃、載氣He、載氣流速1 mL/min、進樣量1 μL、分流比50∶1；升溫程序：170 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至195 ℃，再以3 ℃/min升至230 ℃并保持3 min。

MS條件：電離方式為電子電離，質譜傳輸線溫度260 ℃、離子源溫度230 ℃、MS四極桿溫度150 ℃、質量掃描范圍m/z40～500、溶劑延遲時間2 min，監測模式為全掃描模式。

1.3.6.3 GC-MS定性及定量分析

采用GC-MS全掃描模式分析得到蠶蛹油脂肪酸總離子流圖；使用安捷倫化學工作站的增強型數據分析系統NIST 14.L質譜庫對總離子流色譜峰對應的質譜圖進行解析，根據質譜庫中質譜數據匹配度及脂肪酸甲酯質譜斷裂規律進行定性分析，飽和脂肪酸特征離子質荷比m/z74，單不飽和脂肪酸m/z55，雙不飽和脂肪酸m/z67，多不飽和脂肪酸m/z79；通過安捷倫化學工作站的增強型數據分析軟件計算蠶蛹油中各脂肪酸組分的特征離子響應值，通過面積歸一化法計算脂肪酸組分的相對含量。

1.3.7 油脂中總酚含量的測定

蠶蛹油中總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法[22]。將2.5 mL正己烷加入0.120 g蠶蛹油中，漩渦振蕩溶解1 min，油相加入2.5 mL體積分數80%甲醇溶液后超聲萃取10 min，混合液經10 000 r/min離心10 min。取2 mL甲醇溶液萃取相至10 mL容量瓶中，加入500 μL的Folin-Ciocalteul試劑，混勻1 min后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，使用蒸餾水定容，于室溫下避光反應1 h，于765 nm波長處測定吸光度。以質量分數10% Na2CO3溶液為對照組。配制100 μg/mL的沒食子酸標準溶液，以0、100、200、300、400、500、600 μL沒食子酸標準溶液（蒸餾水定溶至10 mL）對應的吸光度得到標準工作曲線方程y＝0.009 2x＋0.034 6（R2＝0.994 5），蠶蛹油總酚含量以每千克蠶蛹油中所含沒食子酸質量表示，單位為mg/kg。

1.3.8 DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的測定

使用無水乙醇將蠶蛹油分別配制成質量濃度為10、20、30、50 mg/mL和70 mg/mL溶液。DPPH自由基清除率的測定參考Peixoto等[23]的方法。取2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH工作液與2 mL的樣品溶液混合，室溫下避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度，DPPH自由基清除率按式（1）計算。以α-生育酚為陽性對照組，無水乙醇為空白對照組。

式中：A1為蠶蛹油或α-生育酚組的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。

ABTS陽離子自由基清除率測定參考Zhao Ling等[24]的方法并稍作修改。取50 μL樣品溶液與150 μL的ABTS工作液混合，25 ℃避光反應20 min，在734 nm波長處測定吸光度，ABTS陽離子自由基清除率按式（2）計算。以α-生育酚為陽性對照組，無水乙醇為空白對照組。

式中：A1為樣品或α-生育酚與ABTS工作液的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。

抗氧化活性結果以清除50%自由基所需的樣品質量濃度——半抑制質量濃度（median inhibition concentration，IC50）表示。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用Excel 2019軟件進行處理，結果用平均值±標準差表示，每個實驗至少進行3 次重復。采用Image Lab軟件處理電泳圖像，Origin 2019軟件繪圖。通過SPSS 25.0軟件對實驗數據進行單因素方程分析-最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗，分析數據差異顯著性（以P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 貯藏期桑蠶蛹的形態變化

從結繭第6天起對蠶繭取樣，根據蠶蛹形態的變化，于結繭第8、11、12、13天收集蠶蛹，樣品采集時間分別記錄為貯藏期階段I、II、III和IV，各階段蠶蛹形態變化如圖1所示。

圖1 貯藏期中各階段蠶蛹形態變化Fig. 1 Change in morphology of silkworm pupa during storage

在貯藏階段I，蠶蛹表皮呈金黃色，復眼呈淡褐色（圖1A2）。階段II的蠶蛹復眼由淡褐色變為黑色，除復眼外的其余形態特征與階段I無明顯差異（圖1B2）。階段III蠶蛹復眼著黑色，觸角呈現褐色，且肛門部位變為深褐色（圖1C2）。階段IV蠶蛹觸角的顏色變為深褐色，表皮呈現出深土褐色（圖1D2）。階段IV的蠶繭繼續貯藏1～2 d，蠶蛹變態成蛾。蠶蛹在發育期間表皮逐漸變硬且顏色變深，與其體內的漆酶和酪氨酸有關。蛹表皮中的酪氨酸是蠶蛹表皮鞣化過程中的色素前體物質[25]，蠶結繭后蛹的皮膚會分泌酪氨酸的酚類衍生物，經由漆酶作用后形成醌類物質，表皮中的蛋白質發生鞣化，使得蠶蛹的外表皮逐漸變硬、顏色變深，酪氨酸含量會隨著表皮顏色的變深急劇降低[26]。

本實驗通過對不同階段蠶繭、蠶蛹的質量以及蠶蛹的體長進行記錄，發現在蠶蛹發育的過程中，蠶蛹以及蠶繭的質量呈下降的趨勢（表1）。與階段III相比，階段IV蠶繭和蛹的質量顯著降低了10.22%（P＜0.05），而各階段蛹的體長無顯著變化。從階段I～IV（羽化前），蛹體質量下降，蛹體的顏色變深，這與其變態過程中機體營養物質的消化吸收有關。

表1 蠶蛹貯藏期間蠶繭質量、蠶蛹質量及蠶蛹體長（n＝20）Table1 Silkworm cocoon mass, silkworm pupa mass and silkworm pupa body length during storage (n = 20)

2.2 貯藏期桑蠶蛹和繅絲蠶蛹的基本化學成分變化

4 個貯藏階段的蠶蛹以及繅絲蠶蛹的蛋白質、脂肪和灰分質量分數分析結果如表2所示。階段II的蠶蛹蛋白質量分數顯著高于階段I（P＜0.05），貯藏階段III、IV蛋白質量分數沒有顯著差異（P＞0.05）。蛋白質量分數與脂肪質量分數比值（protein/ glyceride，P/G）≥2的昆蟲為高蛋白昆蟲，而P/G＜2的昆蟲為高脂肪昆蟲[27]。本實驗中，蠶蛹P/G在1～2之間，說明蠶蛹是一種高脂肪的食用昆蟲。隨著貯藏的時間延長，蠶蛹脂肪質量分數變化呈現下降的趨勢，這可能是由于貯藏期蠶蛹的發育消耗體內貯藏的脂肪。繅絲蠶蛹的蛋白質和脂肪質量分數介于階段I和階段II的鮮蛹之間，說明繅絲工藝對蠶蛹的蛋白質和脂肪含量無顯著影響。蠶蛹屬于高脂肪昆蟲，可作為食品級昆蟲油脂的提取原料，貯藏時間會影響其基本化學成分含量。后續實驗將對貯藏期桑蠶蛹、繅絲后蠶蛹進行蛋白質組成和油脂組成進行分析，研究貯藏時間及繅絲工藝是否會對蠶蛹蛋白質以及脂肪的組成有影響。

表2 不同貯藏階段的蠶蛹基本化學成分（n＝ 3）Table2 Proximate composition of silkworm pupa during storage (n = 3)

2.3 貯藏期桑蠶蛹和繅絲蠶蛹的蛋白質變化

蠶蛹體內蛋白質在分子質量30、70 kDa附近含量高，隨著貯藏時間延長呈下降趨勢，180 kDa附近的蛋白含量隨著貯藏時間延長不斷增加（圖2）。與階段I和II相比，階段III在70 kDa附近的蠶蛹蛋白含量顯著降低，40～50 kDa范圍出現了新的蛋白質條帶。階段IV在70 kDa和30 kDa附近的蠶蛹蛋白含量均明顯下降。與貯藏期蠶蛹相比，繅絲蠶蛹30 kDa附近的蛋白質含量相對較低，70 kDa附近的蛋白質含量高，且在245 kDa附近出現新條帶。

圖2 貯藏期中不同貯藏階段蠶蛹蛋白的分子質量分布Fig. 2 Molecular mass distribution of silkworm pupa proteins during storage

蠶蛹的蛋白質表達與其生長發育有密切關系。桑蠶中30 kDa附近的蛋白質主要存在于血淋巴中，屬于鱗翅目低密度脂蛋白家族，被稱為30K蛋白。30K蛋白由桑蠶幼蟲的外周脂肪體合成并以階段性依賴的方式轉運到血淋巴，最終以顆粒的形式貯藏在內臟脂肪體中，為非進食的蛹提供生長發育必要的營養物質[28-30]。30K蛋白的抗細胞凋亡活性是目前的研究重點，于威等[31]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統在家蠶卵巢培養細胞（BmN）中表達3 種30K蛋白，發現30Kc6、30Kc12p和30Kc19G1 3 種30K蛋白對H2O2誘導的人血管內皮細胞凋亡有抑制作用。在本實驗中，‘兩廣二號’桑蠶蛹30K蛋白含量隨著蠶繭貯藏時間的延長呈下降趨勢，可能與其基因表達的時間特異性有關。Hou Yong[30]和Sun Quan[32]等均發現‘p50’品系的桑蠶中30K蛋白水平在化蛹前增加，化蛹后表達量下降；李擎等[33]發現在‘菁松’ב皓月’品系桑蠶中30K蛋白基因在5齡期幼蟲中表達量最高，在蛹期表達量次之，到蛾期表達量下降，與本實驗中30K蛋白含量變化趨勢一致。說明蠶蛹30K蛋白表達與蠶蛹發育有關，而與蠶蛹品系無關。

目前對蠶蛹的研究發現70 kDa附近蛋白主要是家蠶貯藏蛋白（storage protein，SP）和酚氧化酶。SP分為SP 1（分子質量82 kDa）、SP 2（分子質量72～76 kDa）和SP 3（分子質量82.1 kDa）[34-36]。SP1屬于昆蟲血藍蛋白家族中的一種六聚體蛋白，是一種雌性家蠶特有蛋白，富含蛋氨酸[37]。蛋氨酸殘基能夠與機體內氧化酶、過氧化氫等多種氧化劑反應形成蛋氨酸亞砜，可降低氧化應激損傷和抗哺乳動物細胞凋亡的活性[38]。SP2蛋白不僅為家蠶的生長發育提供能量，而且對于細胞凋亡具有抑制作用[39]。SP2和SP3具有高度的序列相似性，在家蠶體內形成穩定復合物，該復合物降解后為蠶蛹的發育提供氨基酸來源[40]。昆蟲的酚氧化酶根據作用底物的不同可分為酪氨酸酶類型酚氧化酶和漆酶類型酚氧化酶，Yatsu[41]和Yamazaki[42]等在蠶蛹中分離到的漆酶分子質量為70 kDa，韓宏巖等[43]從家蠶表皮分離純化得到的酪氨酸酶分子質量約為80 kDa。酚氧化酶是黑化反應過程中黑色素合成的關鍵因素，本實驗中階段IV蠶蛹的黑化與70 kDa蛋白的表達相關，但該階段70 kDa附近蛋白質表達量降低的原因未知。本實驗結果表明，繅絲蠶蛹中70 kDa蛋白質含量豐富，可作為70 kDa蛋白質的提取來源。目前，關于桑蠶蛹蛋白質組成及活性的研究較少，其組成變化與生理活性之間的聯系有待于進一步研究。

2.4 貯藏期桑蠶蛹油及繅絲蠶蛹油脂肪酸組成的變化

貯藏期蠶蛹油中含有16 種脂肪酸，繅絲蠶蛹油含有15 種脂肪酸（表3）。在各貯藏階段，樣品含飽和脂肪酸8 種，含量最高的是棕櫚酸（30.70%～32.47%）；單不飽和脂肪酸3 種，含量最高的是油酸（15.08%～16.86%）；多不飽和脂肪酸5 種，含量最高的是α-亞麻酸（26.03%～28.49%）。階段I、階段II蛹油中ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的含量比（ω-6/ω-3）沒有顯著變化，階段IIIω-6/ω-3顯著上升（P＜0.05），蛹油中ω-3脂肪酸含量的動態變化可能與蠶蛹體內的脂肪酸脫氫酶的調節有關[44]。于海彥等[45]研究發現在蠶蛹發育的過程中初期ω-3脂肪酸脫氫酶表達量降低，在發育后期脫氫酶表達量上升，使蛹體內ω-6/ω-3比例上升。與貯藏期蛹油相比，繅絲蛹油未檢出二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），但α-亞麻酸含量顯著較高（P＜0.05），這可能與繅絲工藝中熱處理及脂肪酸的不飽和程度有關。鮮繭繅絲工藝中的加熱溫度低于100 ℃，能夠防止多不飽和脂肪酸的熱裂解或降低蠶蛹油脂的氧化速率，但高溫加速了EPA的氧化分解。

表3 貯藏期各階段蠶蛹油的脂肪酸組成（n＝3）Table3 Fatty acid composition of silkworm pupa oil during storage (n = 3)

目前的研究表明，富含ω-3系α-亞麻酸的蠶蛹油具有抗氧化、降血糖、降血脂和改善記憶的功效[46-47]，本實驗結果表明，隨著貯藏時間的延長，蠶蛹油中ω-3脂肪酸相對含量呈現先上升后下降的趨勢，而繅絲蛹油中的ω-3脂肪酸相對含量高于貯藏期蠶蛹。

2.5 貯藏時間對桑蠶蛹油DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率和總酚含量的影響

蠶蛹油DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50在貯藏期呈減小的趨勢（52.00～20.93 mg/mL和156.81～33.32 mg/mL），總酚含量在貯藏期呈現上升趨勢（15.95～77.50 mg/kg）（表4），各階段蠶蛹油及繅絲蠶蛹油對自由基的清除力與蠶蛹油質量濃度成正比。各貯藏階段的蠶蛹油DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50及油脂總酚含量有顯著性差異（P＜0.05）階段IV蠶蛹油的總酚含量最高（77.50 mg/kg），其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率也達到最高。這一現象可能與蠶蛹貯藏的過程中蛹體內的生理變化有關[43]，實驗的結果表明蠶蛹油體外抗氧化能力可能與蠶蛹體內酚含量呈正相關。繅絲蠶蛹油的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50分別為37.63 mg/mL和92.42 mg/mL，其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率顯著高于貯藏期I和II階段（P＜0.05），但顯著低于貯藏期III和IV階段的蠶蛹油（P＜0.05）。Hu Bin等[12]采用微波輔助聯合乙醇-正己烷混合提取四川雅安地區桑蠶蛹油，并測定其DPPH自由基清除能力，結果發現該方法所提蛹油DPPH自由基清除能力（IC50＝26.47 mg/mL）高于索氏抽提法得到的蠶蛹油（IC50＝34.53 mg/mL）。Manosroi等[48]使用石油醚冷浸提得到的泰國本地蠶蛹油IC50為10.08 mg/mL。本實驗采用正己烷浸提蠶蛹油，階段IV的蠶蛹油DPPH自由基清除能力高于Hu Bin等[12]提取的蠶蛹油，但低于Manosroi等[48]提取的蠶蛹油。階段IV蠶蛹油的總酚含量與Hu Bin等[12]微波輔助聯合乙醇-正己烷法提取的蠶蛹油（78.36 mg/kg）接近，而繅絲蠶蛹油總酚含量低于Hu Bin等[12]索氏抽提法提取的蠶蛹油（42.76 mg/kg），說明蠶蛹的品種、蛹的發育、提取工藝均會影響蛹油的總酚含量及其體外DPPH自由基清除能力。葛雙雙等[49]發現油脂的體外抗氧化活性與其含有的α-亞麻酸共軛雙鍵自由基引起的分子重排有關，該過程包括了單分子加成、碳碳雙鍵氧化及環氧化的復雜過程。本實驗中，階段II的蠶蛹油α-亞麻酸相對含量最高（28.49%），但其DPPH自由基清除能力（IC50＝51.04 mg/mL）低于階段IV蠶蛹油的DPPH自由基清除能力（IC50＝20.93 mg/mL）。此外，本實驗中蛹油DPPH自由基清除率的IC50遠低于其ABTS陽離子自由基清除率的IC50。這可能是由于DPPH自由基與脂溶性的物質具有較強的結合能力，更適用于評價脂溶性的物質的抗氧化活性[50]。綜上，α-亞麻酸含量與蠶蛹油的體外抗氧化活性沒有相關性，蠶蛹油的自由基清除能力可能與蠶蛹油中的酚類物質含量有關。

表4 貯藏階段蠶蛹油自由基清除率和總酚含量Table4 Free radical scavenging capacity and total phenol content of silkworm pupa oil during storage

3 結 論

本實驗所用的‘兩廣二號’桑蠶蛹屬于高脂肪昆蟲，含有豐富的蛋白質和不飽和脂肪酸。貯藏時間顯著影響蠶蛹營養品質及蛹油的抗氧化活性，這可能與貯藏過程中蠶蛹的發育有關。蛹油中的總酚含量與其抗氧化活性呈正相關。蠶蛹是蠶繭繅絲的副產品，目前工業生產收集蠶繭有季節性，蠶繭貯藏條件不穩定且貯藏時間較長，這些會影響繅絲蠶蛹的營養品質和生理活性。因此，繅絲蠶蛹綜合利用可根據不同貯藏時期蠶蛹樣品的營養價值來選擇原料對象，提高繅絲副產物的品質和利用率。