表面活性劑脅迫培養(yǎng)對(duì)4株細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

李淑英，李 燕，胡貴蓮，張翠萍，申太波，劉淑娟，周元清

(玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 云南 玉溪 653100)

0 引言

表面活性劑是一類加入微少量就能使表面張力減少的有機(jī)物，有殺菌、潤(rùn)滑等功能，被廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，大量使用時(shí)，會(huì)帶來(lái)很多嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)較大影響[1]。表面活性劑對(duì)微生物的毒性，一方面是通過(guò)與細(xì)胞膜中的液態(tài)成分作用使細(xì)胞膜溶解，另一方面是通過(guò)與細(xì)胞中的重要功能蛋白發(fā)生反應(yīng)[2]，表面活性劑的毒性與類型及表面活性劑濃度有關(guān)[3,4]。十二烷基硫酸鈉(SDS)為白色或淡黃色粉狀，有去污、乳化和優(yōu)異的發(fā)泡力，是一種陰離子表面活性劑；聚乙二醇6000(PEG6000)為白色蠟狀固體薄片或顆粒狀粉末，屬于非離子型表面活性劑[5]。表面活性劑在工業(yè)行業(yè)中應(yīng)用較廣泛，有殺菌與消毒作用，其主要原因是可以和細(xì)菌生物蛋白質(zhì)發(fā)生作用，加速蛋白質(zhì)分子變性[6]，所以微生物生長(zhǎng)變化可以直接反映出水體受污染程度，將微生物作為表面活性劑毒性監(jiān)測(cè)指示者具有一定的實(shí)用價(jià)值[7]。

本實(shí)驗(yàn)選擇4株細(xì)菌作為研究對(duì)象。2株革蘭氏陽(yáng)性菌：枯草芽孢桿菌和簡(jiǎn)單芽孢桿菌；2株革蘭氏陰性菌：大腸桿菌和變形桿菌。用不同濃度的表面活性劑PEG6000、SDS脅迫培養(yǎng)后，對(duì)4株細(xì)菌測(cè)定生長(zhǎng)曲線，分析不同濃度PEG6000、SDS對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4株細(xì)菌對(duì)兩種表面活性劑表現(xiàn)出不同的敏感性，兩種表面活性劑對(duì)細(xì)菌的毒性也表現(xiàn)出較大差異，為表面活性劑污染環(huán)境后對(duì)細(xì)菌的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

枯草芽孢桿菌(BaciLLussubtiLis)，簡(jiǎn)單芽孢桿菌(BaciLLussimpLex)，革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)；

大腸桿菌(EscherichiacoLi)，變形桿菌(ProteusvuLgaris)，革蘭氏陰性菌(G-)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g；酵母膏5g；NaCl 10g；蒸餾水1000mL。

1.3 方案設(shè)計(jì)

1.3.1 菌種活化

將4株供試菌種在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，于35℃恒溫培養(yǎng)24h后備用。

1.3.2 不同濃度表面活性劑培養(yǎng)基配制

250mL錐形瓶盛100mL LB液體培養(yǎng)基，加入PEG6000，濃度分別為：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L，每個(gè)濃度3個(gè)平行；加入SDS，濃度分別為：0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L，每個(gè)濃度3個(gè)平行；同時(shí)設(shè)置對(duì)照。

1.3.3 脅迫培養(yǎng)

將活化后的斜面菌種用3mL無(wú)菌水洗脫3次，合并倒入無(wú)菌試管中混勻。

用10mL的移液管將脅迫培養(yǎng)基分別加入三角瓶中，每個(gè)三角瓶10mL，用牛皮紙包扎好置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。滅菌后，分別按照濃度梯度為0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L添加PEG6000，0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L添加SDS，另以不含表面活性劑的培養(yǎng)基作對(duì)照，在無(wú)菌條件下將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按10%的接種量分別接種于上述培養(yǎng)基中，置于搖床(120r/min)上恒溫(35℃)搖瓶培養(yǎng)。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

培養(yǎng)過(guò)程(96h)中每隔8h無(wú)菌操作取樣1次，于可見(jiàn)光分光光度計(jì)600nm處測(cè)其吸光度，每個(gè)樣品有3個(gè)平行，求其平均值，繪制4種細(xì)菌在不同濃度PEG6000、SDS脅迫培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG6000 脅迫對(duì)4株細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1～圖3可看出，PEG6000對(duì)枯草芽孢桿菌、簡(jiǎn)單芽孢桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)有影響，PEG6000濃度為0.5～2.0g/L時(shí)，對(duì)3株細(xì)菌的生長(zhǎng)都表現(xiàn)為抑制作用；當(dāng)PEG6000濃度為2.0g/L時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑制作用明顯；簡(jiǎn)單芽孢桿菌則表現(xiàn)為PEG6000濃度為1.0g/L生長(zhǎng)受到明顯抑制。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，低濃度表面活性劑(TCJ0.1g/L和KPS 0.2g/L)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高濃度(1.5g/L)表面活性劑對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出抑制作用，本實(shí)驗(yàn)中PEG6000對(duì)枯草芽孢桿菌、簡(jiǎn)單芽孢桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)都表現(xiàn)為抑制作用。聚乙二醇6000(PEG6000)是廣泛選用的模擬干旱的滲透劑[9]，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有較大影響，PEG6000對(duì)枯草芽孢桿菌、簡(jiǎn)單芽孢桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用較TCJ和KPS明顯,本實(shí)驗(yàn)選擇PEG6000濃度較高也會(huì)影響3株細(xì)菌的生長(zhǎng)。

圖1 PEG6000脅迫下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

圖2 PEG6000脅迫下簡(jiǎn)單芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

圖3 PEG6000脅迫下大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

由圖4可看出，變形桿菌PEG6000脅迫培養(yǎng)有較強(qiáng)的耐受性和適應(yīng)性，在96h內(nèi)變形桿菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，24h內(nèi)變形桿菌的生長(zhǎng)低于對(duì)照，說(shuō)明一段時(shí)間內(nèi)PEG6000對(duì)變形桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，變形桿菌的生長(zhǎng)逐漸升高，應(yīng)該是大腸桿菌對(duì)PEG6000脅迫環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，過(guò)度地使用表面活性劑也可能使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在低濃度下，PEG6000對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)具有一定的刺激作用，在高濃度下，對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，但是抑制效果不太明顯，對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)還是表現(xiàn)為促進(jìn)作用。說(shuō)明PEG6000的毒性不是太強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的脅迫作用不太顯著。且兩種細(xì)菌對(duì)PEG6000的敏感程度不同，枯草芽孢桿菌(G+)比假單胞菌(G-)更敏感，可能原因是兩種細(xì)菌的結(jié)構(gòu)差異和對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力不同[5]。

2.2 SDS脅迫培養(yǎng)對(duì)4株細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖5～圖8可看出，SDS對(duì)4株細(xì)菌的生長(zhǎng)影響較大，本實(shí)驗(yàn)SDS>0.4g/L后對(duì)4株細(xì)菌的生長(zhǎng)都表現(xiàn)為抑制作用，與雷鳴[11,12]等人研究結(jié)果類似，其結(jié)果表明表面活性劑質(zhì)量濃度>0.5g/L時(shí)，微生物種群數(shù)量降低。SDS對(duì)納豆芽胞桿菌的生長(zhǎng)具有較大的影響，即使在0.2g/L的低濃度下也不能使菌體正常生長(zhǎng)[13]，本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)SDS濃度為0.2g/L時(shí)，4株細(xì)菌在一段時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)明顯受到抑制，后期對(duì)SDS表現(xiàn)出不同的適應(yīng)能力：枯草芽孢桿菌40脅迫培養(yǎng)40h后開(kāi)始有生長(zhǎng)，大腸桿菌與變形桿菌脅迫培養(yǎng)56h后出現(xiàn)生長(zhǎng)現(xiàn)象，而簡(jiǎn)單芽孢桿菌對(duì)SDS脅迫環(huán)境適應(yīng)能力較弱，直至88h后才開(kāi)始生長(zhǎng)。4株細(xì)菌在初期培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)一定濃度SDS(本實(shí)驗(yàn)為0.2g/L)耐受性較弱的菌群大量死亡，少量耐受性較強(qiáng)的菌群由于外界環(huán)境變化所造成的環(huán)境脅迫會(huì)誘惑其產(chǎn)生保護(hù)或適應(yīng)機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化，從而使其生存能力提高，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量大量增加[14]。枯草芽孢桿菌是用于研究芽孢萌發(fā)的模式微生物，對(duì)其芽孢萌發(fā)的特點(diǎn)及機(jī)制[15,16]較多，環(huán)境因素會(huì)影響芽孢萌發(fā)，同時(shí)芽孢在其他因子，如溶菌酶、鹽、高壓、2，6吡啶二羧酸鈣(Ca+-DPA)以及陽(yáng)離子表面活性劑作用下也能萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)中選擇的簡(jiǎn)單芽孢桿菌是從濕地植物-香蒲根際經(jīng)過(guò)HCB多次脅迫培養(yǎng)篩選分離到的內(nèi)生細(xì)菌，研究[17]發(fā)現(xiàn)該菌株芽孢形成時(shí)間較早，基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h即出現(xiàn)芽孢，這一特征有別于其他芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌為46h)。其他生物學(xué)特性還在進(jìn)一步研究中，芽孢萌發(fā)“多信使，多受體”假說(shuō)認(rèn)為超表達(dá)芽孢的萌發(fā)受體能增加萌發(fā)速率，而低表達(dá)則會(huì)出現(xiàn)深度休眠芽孢[18]，簡(jiǎn)單芽孢桿菌在脅迫環(huán)境中是否產(chǎn)生了深度休眠芽孢導(dǎo)致其在SDS(0.2g/L)環(huán)境中芽孢的萌發(fā)延遲還需深入研究，該菌株在本實(shí)驗(yàn)中芽孢萌發(fā)時(shí)間為80h。

圖5 SDS脅迫下枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

圖6 SDS脅迫下簡(jiǎn)單芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

圖7 SDS脅迫下大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

圖8 SDS脅迫下變形桿菌生長(zhǎng)曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SDS在低濃度下(本實(shí)驗(yàn)為0.2g/L)對(duì)4種細(xì)菌的生長(zhǎng)前期有明顯的抑制作用，說(shuō)明SDS的毒性比PEG6000更強(qiáng)，SDS濃度為0.4g/L時(shí)，4株細(xì)菌的生長(zhǎng)已經(jīng)完全被抑制。研究[19,20]認(rèn)為兩類細(xì)菌對(duì)外界污染的敏感程度不同，G+比G-更敏感，原因是兩類細(xì)菌結(jié)構(gòu)及成分有差異，導(dǎo)致其解毒抗性能力不同，對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力也不同。

3 結(jié)論

3.1 4株細(xì)菌對(duì)兩種表面活性劑的敏感性不同

PEG6000(濃度：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L)和SDS(濃度：0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L)對(duì)簡(jiǎn)單芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌都有抑制作用，其中PEG6000有抑制現(xiàn)象但3株細(xì)菌還有生長(zhǎng)，SDS濃度>0.4g/L 3株細(xì)菌的生長(zhǎng)完全停止，SDS濃度為0.2g/L時(shí)培養(yǎng)一段時(shí)間3株細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始增加，應(yīng)該是遺傳變異所致；變形桿菌對(duì)PEG6000和SDS表現(xiàn)有差異，該實(shí)驗(yàn)濃度條件下PEG6000促進(jìn)變形桿菌的生長(zhǎng)，變形桿菌在SDS(0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L)條件下生長(zhǎng)完全被抑制，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種細(xì)菌在PEG6000和SDS的脅迫作用下，G+比G-更敏感。

3.2 不同的表面活性劑對(duì)微生物的毒性有明顯差異

實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定陰離子表面活性劑(SDS)和非離子表面活性劑PEG6000對(duì)4株細(xì)菌脅迫后生長(zhǎng)曲線的變化后發(fā)現(xiàn)，低濃度(0.2g/L))的SDS對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，當(dāng)SDS濃度>0.4g/L后對(duì)4株細(xì)菌的生長(zhǎng)完全抑制；相對(duì)高濃度(2.0g/L)的PEG6000對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)也有抑制作用，變形桿菌在此濃度下表現(xiàn)為促進(jìn)作用，兩種表面活性劑對(duì)4種細(xì)菌的毒性順序?yàn)镾DS>PEG6000。