白三葉草葉片感染白粉病的細胞生理變化及其病原鑒定

楊凱，史娟，袁玉濤，王立婷

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川750021）

白三葉（Trifolium repens）屬于豆科（Leguminosae）三葉草屬（Trifolium），原產于歐洲和北非，是我國廣泛栽培應用的優質豆科牧草之一［1-2］，常見的野生種有白三葉、紅三葉（Trifolium pratense）、草莓三葉草（Trifolium fragiferum）和野火球（Trifolium lupinaster）4 種［3-4］。三葉草生態適宜性強，在改善國內外城鎮土壤有機質、培肥地力、綠化和水土保持等方面發揮著重大作用［5］，因其營養物質豐富、適口性好、品質優良，已成為反芻動物的重要飼料來源［6-8］。目前，國家致力于農業結構改革和草畜產業的發展，三葉草因其品質優良、觀賞性強被廣泛種植。

白粉病是牧草生產過程中的主要真菌病害。豆科、禾本科屬的多種牧草均可被白粉菌侵染［9］，白粉菌侵染不僅使牧草光合速率下降，葉片早枯，且對牧草的品質及產量產生一定影響，在我國新疆、吉林、江蘇等地均有報道［10］。楊芬［11］以有性階段的閉囊殼和無性孢子特征，將新疆園林草坪三葉草白粉病病原無性時期鑒定為半知菌亞門粉孢屬（Oidium），有性時期為子囊菌亞門白粉菌屬（Erysiphe）；桑維均等［12］研究表明貴陽地區紅三葉草白粉病以菌絲體和分生孢子在植株上越冬、越夏，成為來年侵染源，但未發現有性世代。袁玉濤等［13］依據分生孢子和閉囊殼形態特征，明確了寧夏地區紫花苜蓿（Medicago sativa）白粉病病原為蓼白粉菌（Erysiphe polygoni）。李帥等［14］研究番茄（Lycopersicon esculentum）白粉病病原，因未發現閉囊殼，利用無性態分生孢子特征及分子鑒定法明確了黑龍江省番茄白粉病病原種類。寧夏氣候干旱，白三葉草作為重要的園林綠化草種，白粉病發生逐年加重，有關致病菌的分類地位目前尚不明確，因此，明確寧夏地區白三葉草白粉病病原菌的種類，可為指導防控提供依據。

植物病原真菌順利侵入寄主進而建立寄生關系是發病的基礎。當病原菌侵入寄主時，通常會產生一些侵染結構，如附著胞、侵染釘等來幫助侵入，對于專性寄生型真菌，通常以吸器進入寄主細胞獲得營養，并與寄主建立寄生關系［15］。白粉菌是典型的活體營養型真菌，在植物體內以吸器的形成標志和寄主建立寄生關系［16］。任斌等［17］使用光學顯微鏡及透射電鏡觀察了葉枯病菌侵染蘋果（Malus domestica）葉片的發育情況及侵染過程，研究表明接種9 h 分生孢子萌發產生芽管且附著胞形成，1 d 后芽管頂部形成次級分生孢子，2 d 后次級分生孢子萌發形成附著胞，3 d 后附著胞演變為侵染釘侵入寄主，表皮細胞內可見初生及次生菌絲形成且葉片顯癥。楊若林等［18］通過半薄及超薄切片觀察了白粉菌侵染小麥（Triticum aestivum）葉片細胞的顯微及超微結構變化，結果發現受感染小麥葉片細胞細胞壁沉積大量團狀電子致密顆粒，線粒體膜解體，葉綠體由橢圓形變為圓形。研究結果對于解析寄主感病引起的病理變化以及深入揭示病原菌的侵入機制提供了重要的細胞學證據。為了揭示白三葉草白粉病菌侵入寄主及其引起的細胞病理學特征，本研究對白粉病菌的生物學特性以及白粉菌侵染寄主的組織病理學特征進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白三葉草種子由寧夏大學農學院牧草分子育種研究室提供。

白三葉草白粉病菌菌株：來源于寧夏銀川市綠化地自然感染白粉病的白三葉草上，以BF 表示。

1.2 主要化學試劑

真菌DNA 提取試劑盒（Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit）購于BioFlux 公司；2×EcoTaq?PCR SuperMix（+dye）購自北京全式金生物技術有限公司；水合氯醛和三氯乙酸購于博奧生物集團有限公司；乙醇、氯仿和苯胺藍購于天津大茂化學試劑有限公司。

1.3 白三葉草的培育、白粉病菌的繁殖及接種方法

1.3.1 白三葉草的培育 2018年6月采用盆栽法培育白三葉草。將無菌基質土（基質∶土=1∶1）拌水，裝入10盆直徑為15 cm 的花盆中1/2 處，選飽滿的白三葉草種子在55 ℃恒溫水中浸泡2 h 以催芽，均勻地播撒在花盆中，覆基質土1 cm，澆透水，用保鮮膜保濕，置于RQX-250 智能人工氣候箱（上海甄明科學儀器有限公司，中國）培育，培育條件設定為：溫度25 ℃、14 h/10 h 光暗交替4000 lx、濕度75%，出苗后去掉保鮮膜，正常管理，長至四葉一心時進行接種。

1.3.2 白粉病菌的繁殖 采集新鮮的BF 菌株，接種于盆栽培養的健康白三葉草葉片上，放入培養室培養。促其產生大量白粉層，作為接種菌源。

1.3.3 接種方法 采用震動抖落法接種［13］。采集長滿新鮮白粉菌的白三葉草葉片，置于被接種白三葉草葉片上方4～7 cm 處，輕輕震動，使白粉菌均勻落在被接種葉片，5 min 后在接種葉片上方噴霧。

1.4 病原菌在寄主表面的萌發特征及侵染寄主的超微結構觀察

1.4.1 白粉菌侵染白三葉草表面癥狀觀察 按照1.3.3 方法進行。于接種后每隔1 d 觀察1 次。觀察葉片顯癥和病斑擴展的時間。

1.4.2 白粉菌在白三葉草表面萌發特征觀察 采用葉片透明法［19］，將接菌的葉片每隔3～4 h 取樣置于脫色液中脫色24 h 后倒掉脫色殘余物換為透明液，24 h 后取出透明好的葉片使用苯胺藍染色液染色5 min 后觀察，使用BX53 顯微鏡（奧林巴斯株式會社，日本）觀察分生孢子、芽管、附著胞、菌絲及分生孢子梗的形態和大小，并測量拍照做好記錄。

1.4.3 透射電鏡樣品的制備和觀察 參照康振生［20］的方法制備樣品。將制備好的樣品在解剖鏡下進行修塊，在EM KMR3 超薄切片機（Leica 公司，德國）上切片，用1%甲苯胺藍染色液染色，經流動水沖洗染色液并烤干，在顯微鏡下進行觀察和拍照。利用半薄切片進行樣品定位，超薄切片經2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色并晾干，使用1200 EX 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社，日本）觀察并拍照。

1.5 病原菌形態特征觀察

采用光學顯微鏡直接觀察。滴一滴無菌水于載玻片上作為浮載劑，將白粉菌抖落在載玻片上，蓋上蓋玻片，在BX53 顯微鏡（奧林巴斯株式會社，日本）下觀測病原菌形態特征。

1.6 病原菌分子生物學鑒定

1.6.1 樣品DNA 的提取 采用單斑繁殖純化白粉病菌，反復多次培養獲得生長一致的白粉病菌菌落，用滅菌手術刀片輕輕刮取葉片表層菌絲，稱取0.1 g 白三葉草白粉菌菌絲，使用真菌DNA 提取試劑盒［Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux 公司）］提取白三葉草白粉病病菌菌絲體DNA［21］，使用Simpli Nano 超微量分光光度計（GE 公司，美國）測定濃度，-20 ℃保存備用。

1.6.2 引物選擇與PCR 擴增 使用rDNA-ITS 通用引物序列ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取的白三葉草白粉病菌菌絲體DNA 進行PCR 擴增。PCR 反應體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL，ITS1 引物0.5 μL、ITS4 引物0.5 μL，ddH2O 補足。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共設置35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察拍照后，回收產物交由昆泰銳（武漢）生物技術有限責任公司測序。將菌株測序所得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）數據庫中進行BLAST 同源性比對，基于GenBank 中報道的相關病原菌的序列信息豌豆白粉菌（Erysiphe pisi）（登錄號為KY661145.1 和KY661137.1），采用鄰接法（neighbor-joining method），通過Mega 5.1 軟件構建系統發育樹，自展重復數為1000 次。確定白粉病菌菌株的分類地位。

1.7 分生孢子生物學特性觀察

設溫度、pH 和光照3 個處理。其中溫度梯度處理為5、10、15、20、25、28 和30 ℃；pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0；光照處理為全黑暗、12 h 光照×12 h 黑暗交替、全光照。

采用水瓊脂玻片法［22］觀察。每個處理3 次重復，置于RQX-250 智能人工氣候箱（上海甄明科學儀器有限公司，中國）培養，分別于4、6、8、12 和24 h 觀察。觀察分生孢子的萌發，計算萌發率，每重復觀察統計3 個視野，每視野觀察到的孢子個數≥100 個。

萌發率（%）=分生孢子的萌發個數/視野內總孢子數×100

1.8 數據分析

采用SPSS 20.0 進行單因素方差分析，用Duncan 多重比較進行差異顯著性分析（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 白粉菌侵染白三葉草葉片癥狀觀察

接種后第4 天，葉片表面顯癥，出現稀疏的白粉層（圖1B）；第5 天，白粉層逐漸加厚并開始擴展（圖1C）；第6 和7 天，粉斑擴展至葉片的1/3～2/3（圖1D，E）；第10 天，粉層覆蓋率達到90%以上，粉層加厚，此時葉片出現卷曲（圖1F）；15～20 d，整個葉片粉層加厚，葉片變黃，萎蔫，并逐漸枯落（圖1G，H），但始終沒有觀察到閉囊殼。由4 d顯癥至15 d 布滿整個葉片大約需要11 d，通過比葉重法測定葉片面積，得到菌絲生長速率為34.47 mm2·d-1。

圖1 白粉病菌危害白三葉草葉片癥狀Fig.1 Symptoms of leaf damage of T.repens by E.pisi

2.2 分生孢子在葉片表面的萌發特性觀察

在25 ℃條件下，接種在葉片上的分生孢子，4 h 時開始萌發，在分生孢子頂端肩胛處長出初生芽管（圖2A），10 h 后芽管頂端膨大，形成橢圓形或球形的附著胞（圖2B）；部分孢子另一側肩胛亦可萌發產生初生芽管，形成長圓形的附著胞（圖2D），12 h 后附著胞與葉面接觸一側或頂端萌發形成侵染釘（圖2C），并開始侵入葉片組織，有的分生孢子另一端肩胛處萌發長出芽管，芽管生長到一定長度侵入組織獲取營養，形成拱狀菌絲，每個拱狀菌絲基部（圖2C-Rt）侵入寄主組織產生吸器；24 h 分生孢子芽管基部直接長出初生菌絲（圖2D），隨著初生菌絲的生長，分生孢子逐漸由飽滿變為扁形，此時芽管生長所需的營養由分生孢子提供；48 h 后各菌絲形成分枝，產生次生菌絲（圖2E），表明白粉菌開始通過吸器吸收營養，亦表明白粉菌和寄主成功建立寄生關系；96 h 后，大量菌絲網狀交織（圖2F），此時葉片表面已經開始顯癥，可以觀察到白色粉層；144 h 后菌絲層變厚，顯微觀察菌絲每隔51.79～77.68 μm 形成一個直立的孢子梗（圖2G）；孢子梗繼續生長，168 h 后，每個孢子梗串生2～3 個分生孢子，向基性成熟脫落（圖2H），解剖鏡下觀察分生孢子梗排列整齊，長度基本一致（圖2I）。

圖2 白粉病菌在白三葉草葉片的發育情況Fig.2 Development of E.pisi in T.repens

2.3 白三葉草感染白粉病菌的組織病理變化和細胞超微結構觀察

觀察初顯癥（接種白粉菌4 d）白三葉草葉片的組織切片（圖3B），清晰看到葉片表皮細胞表面附著大量的菌絲（Hp），且菌絲已經侵入寄主的表皮細胞形成吸器（Hs），表明此時白粉病菌已經通過吸器吸收寄主營養供菌絲生長，而在柵欄組織和海綿組織均未觀察到侵入菌絲。正常的白三葉草組織結構完整（圖3A），柵欄細胞排列整齊，海綿細胞排列緊密，維管束發達；而受到白粉病菌侵染的柵欄組織和海綿組織細胞排列疏松，且維管束萎縮，但是整體結構尚完整，表明侵染早期，白粉病菌對寄主組織結構的破壞性較小。

圖3 正常白三葉草寄主組織與受白粉病菌侵入寄主組織的半薄切片Fig.3 A semi-thin section of normal T.repens host tissue and powdery mildew invaded the host tissue

超微結構觀察發現，白粉病菌菌絲內含有細胞核（Nu）、大液泡（Bv）、囊泡（Ve）、線粒體（Mi）和核糖體（Ri），部分線粒體及多個囊泡排列于細胞質膜內側（圖4A，B），菌絲一側形成凸起進行延長生長且頂端邊緣具有膜性物（圖4A，C）；菌絲有隔且內有大量的液泡聚集，細胞核臨近菌絲頂端（圖4D，E），分析可能是隨著菌絲生長，大量液泡產生壓力將細胞核和線粒體推向菌絲頂部；同時觀察到白粉菌菌絲侵入寄主前，與寄主接觸部位的表皮細胞細胞壁加厚，顏色加深，對應的細胞內側略凹陷（圖4F），寄主響應病原菌侵染形成的此種結構可能是細胞壁抵御病菌侵入產生的反應，也可能是病原菌侵入誘導寄主產生的反應。菌絲通過保衛細胞和表皮細胞交界處，以直接侵入方式侵入寄主細胞壁，侵入寄主細胞壁組織的菌絲頂端膨大，中間有一近圓形的電子致密度高的區域，該區域向菌絲頂端輻射分布多個小的囊泡和顆粒狀物，被侵染的寄主細胞壁組織被降解，且顏色加深，鄰近的氣孔通道變形，保衛細胞內發生質膜分離現象（圖4G），但并未觀察到侵入結構。與侵入菌絲對應的表皮細胞內側形成電子致密度較高的胞壁沉積物，細胞壁和質膜不再完整（圖4H，I），而表皮細胞內的胞壁沉積物可能是病原菌誘導寄主產生病程相關蛋白，也可能是寄主的病理反應；同時還觀察到表皮細胞內形成了吸器（圖4J）；吸器被寄主原生質膜包裹將吸器與寄主細胞質隔開，使吸器與寄主質膜間構成了一個較大的交界面，吸器細胞壁外被一層較厚的膜包圍（圖4J，K），吸器內充滿顏色較深的物質，且顏色明顯重于菌絲細胞，但是沒有觀察到液泡。從試驗結果可充分看出吸器和菌絲細胞內的細胞器、細胞質物質明顯不同，吸器與質膜間的交界面很可能是病菌與寄主間識別、營養物質交換的場所，而吸器外膜很可能是吸器為了抵御寄主分泌物的破壞。隨著病原菌通過進一步侵入和擴展，柵欄細胞內部葉綠體細胞器腫脹，聚集，呈球形，有的葉綠體已被破壞，基粒片層不明顯，隨著葉綠體變形程度的增加，細胞內的嗜鋨顆粒增多（圖4L）；沒有聚集的葉綠體腫脹，與細胞質膜分離，分離區域充滿顆粒狀物，淀粉粒由長條形變為橢圓形或三角形，嗜鋨顆粒增多、基粒片層等結構發生了明顯的變化（圖4M）；正常的葉綠體細胞呈梭形，緊貼于細胞質膜，內部可見淀粉粒，嗜鋨顆粒、基粒片層清晰，葉綠體膜完整（圖4N）；正常的白三葉草表皮細胞細胞壁較厚，氣孔通道和保衛細胞結構完整（圖4O）。

圖4 病原菌侵入寄主細胞的超微結構特征Fig.4 Ultrastructural characteristics of pathogen invading host cells

2.4 白粉菌形態學觀察

形態特征觀察結果表明：白三葉草白粉病菌分生孢子呈橢圓形或卵圓形，大小為（12.41～24.52）μm×（25.95～45.02）μm，平均大小為17.36 μm（標準差standard deviation，SD=2.20）×34.16 μm（SD=3.93）（圖5A）。葉片上觀察到的分生孢子梗直立，每個孢子梗串生2～3 個分生孢子，分生孢子梗長度為（6.64～12.46）μm×（21.94～59.48）μm，平均長度為9.95 μm（SD=1.58）× 46.19 μm（SD=9.00）（圖5B）。在水瓊脂玻片上觀察到分生孢子萌發產生的芽管較長，芽管頂端略膨大，中部下方凸起形成侵入結構（圖5C），在葉片上觀察到分生孢子萌發產生芽管，芽管頂端膨大形成橢圓形的附著胞，附著胞大小為（3.27～7.82）μm×（6.51～13.66）μm（圖5D）。形態特征與《真菌鑒定手冊》［23］和《中國真菌志第一卷·白粉菌目》［24］中豌豆白粉菌描述基本一致，隸屬子囊菌亞門真菌（Ascomycotina）。

圖5 白三葉白粉病病原菌的形態特征Fig.5 Morphological characteristics of fungus causing powdery mildews on T.repens

2.5 白粉菌的分子鑒定

經過PCR 擴增，分別獲得了2 個菌株BF1和BF2的ITS 序列長度分別為681 和696 bp（圖6），將BF1、BF2與Genbank 中已知序列進行Blast 比對分析，發現BF1、BF2與豌豆白粉菌同源性均達到99%。系統發育樹顯示BF1和BF2與豌豆白粉菌（登錄號為KY661145.1 和KY661137.1）在同一分枝（圖7）。本研究認為，BF 菌株為豌豆白粉菌。

圖7 ITS 序列構建的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree constructed by ITS sequence

2.6 白粉菌分生孢子生物學特性觀察

由表1可知，分生孢子對溫度適應范圍較寬，在5～30 ℃均可萌發，4 h開始萌發，24 h 時，15、20 和25 ℃萌發率分別達到40.47%、35.85%、47.53%。表明25 ℃最適白粉菌分生孢子萌發。而5 ℃條件下，4 h基本不萌發，24 h 時萌發率僅為7.55%。各時間段萌發增長率不一，25 ℃萌發增長率在4～6 h 最高。

表1 不同溫度對白三葉草白粉菌分生孢子萌發的影響Table 1 Effects of different temperatures on the conidia germination of powdery mildew in T.repens

不同光照條件的試驗結果表明（表2），4 h 時全光照處理萌發率最大為20.06%，其次是光暗交替，最小是全黑暗為8.33%，全光照與全黑暗在4 h 時有顯著性差異，6、8、12 和24 h 萌發率無顯著差異，但全光照萌發率整體高于全黑暗，表明光照條件有利于白粉病菌分生孢子的萌發。

表2 不同光照對白三葉草白粉菌分生孢子萌發的影響Table 2 Effect of different lights on the conidia germination of powdery mildew in T.repens（%）

不同pH 對分生孢子萌發的試驗結果表明（表3），pH 4.0～9.0 時分生孢子均可萌發，在萌發24 h 時pH 6.0～8.0 之間萌發率無顯著性差異，pH 7.0 為最適，萌發率達到45.50%，pH 4.0 萌發率最低，僅為15.78%，4 h 時pH 6.0 和pH 7.0 萌發率具有極顯著差異，說明在中性或略偏酸性條件更適宜分生孢子萌發。

表3 不同pH 對白三葉草白粉菌分生孢子萌發的影響Table 3 Effects of different pH on the conidia germination of powdery mildew in T.repens（%）

3 討論

利用光學顯微鏡及透射電鏡觀察白粉菌在寄主表皮細胞的發育情況及侵染方式是研究白粉菌與白三葉草互作機理的重要內容。Bushnell［25］觀察白粉菌侵入小麥表皮組織發現，接種白粉菌13 h 后，在表皮組織內觀察到了吸器結構的形成。本試驗觀察白粉病菌侵染白三葉草葉片12 h 時附著胞一側形成侵染釘，形成吸器侵入寄主組織。研究結果與麥類白粉菌（Erysiphe graminis）［25］以及橡膠樹白粉病菌（Oidium heveae）［26］侵染寄主的研究結果基本一致。通過菌絲生長過程發現，分生孢子前期自身提供營養促使菌絲生長，待菌絲順利侵入寄主，分化出大量次生菌絲，此時分生孢子已不能滿足菌絲生長條件，而是通過吸器吸收寄主營養進行生長，此時表明白粉菌與寄主成功建立了寄生關系。張詠梅等［27］研究發現紫花苜蓿受白粉菌侵染后，葉片的柵欄組織結構變形，可進行光合作用的葉肉細胞增多。本試驗無論是柵欄組織細胞還是海綿組織中均未觀察到有菌絲侵染，雖然柵欄組織細胞結構尚完整，但是細胞排列疏松，尤其是柵欄組織細胞內的葉綠體腫脹變形聚集，分析認為可能是病原菌分泌了降解酶破壞了葉綠體膜和類囊體膜，導致葉綠體瓦解。葉綠體結構的完整性是保障植物進行光合作用的基礎［28］，淀粉粒和嗜鋨顆粒數量的變化是維持葉綠體結構穩定的一種動態調節機制。研究表明，葉綠體結構被破壞時，光合作用合成的糖類輸出受阻或產量降低而迅速轉化為淀粉，導致淀粉在葉綠體中大量累積形成淀粉粒［29］，而嗜鋨顆粒是類囊體膜的動態脂質庫，當類囊體膜中脂質過高嗜鋨顆粒就會吸收變多［30］。Van Wijk 等［31］認為類囊體膜解體與嗜鋨顆粒超量化有著很強的相關性，當植物暴露于干旱或高光時嗜鋨顆粒迅速增加，脅迫解除后嗜鋨顆粒減小。劉敏等［32］在研究葡萄（Vitis vinifera）葉片受高溫脅迫后葉綠體超微結構變化發現，葉綠體膨脹，葉綠體膜解體，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多變大。徐威等［33］在研究NaCl 脅迫對白三葉草葉片超微結構變化發現，在低鹽脅迫下，葉綠體開始變形，基粒片層松散變形，淀粉粒與嗜鋨顆粒增多。本試驗觀察到白粉病菌侵入白三葉寄主細胞，破壞葉綠體細胞，導致淀粉粒變形數量增多，而嗜鋨顆粒數量隨著葉綠體細胞變形程度的增加而增加，與前人研究結果一致，亦充分表明，淀粉粒和嗜鋨顆粒是葉綠體應對生物或非生物脅迫的一種響應機制。史娟等［34］認為苜蓿假盤菌定殖在苜蓿葉片內的病菌菌絲，首先破壞的細胞器是葉綠體。苜蓿褐斑病引起牧草質量下降和光合速率降低，從細胞學角度揭示了感病苜蓿品質下降的生理學機制。感病白三葉草的品質是否會受到影響需要進一步研究闡明。本試驗同樣觀察到已侵入與未侵入寄主的菌絲結構存在一定差異，未侵入寄主的菌絲頂端存在線粒體結構，而已侵入寄主的菌絲頂端存在一近圓形的電子致密物，二者頂端結構的差異，亦可能造成二者的生長機制與侵染方式存在差異。

豌豆白粉菌隸屬于白粉菌目真菌，主要寄生于黃芪（Astragalus membranaceus）、苜蓿、草木樨（Melilotus officinalis）、豌豆（Pisum sativum）、蠶豆（Vicia faba）等豆科植物上［24］。國內外對白三葉草白粉病的相關研究較少，而陳曙暉等［35］依據紅三葉草白粉病菌絲寄生于寄主表面，分生孢子無色呈橢圓形串生于孢子梗頂端，大小為（13～16）μm×（24～33）μm 等形態學特征，將貴州人工草場紅三葉草白粉病病原菌鑒定為半知菌亞門粉孢霉屬白粉粉孢霉菌（Oidium erysiphoides），有性階段為蓼白粉菌。燕勇等［36］認為將ITS 序列分析結果與傳統形態學鑒定結果相結合能更準確地鑒定真菌。由于尚未發現白三葉草白粉病菌的有性態，因此，利用無性態結構特征，結合分子生物學鑒定亦是確定病原菌有效的辦法。本試驗通過觀察白三葉草白粉菌分生孢子、分生孢子梗、芽管及附著胞的形態和大小等形態學特征，并與《真菌鑒定手冊》［23］和《中國真菌志第一卷·白粉菌目》［24］進行對照。同時對白粉菌菌株進行分子生物學鑒定，認為寧夏地區白三葉草白粉病由子囊菌亞門豌豆白粉菌侵染所致。

生物學試驗結果表明白粉菌在5～30 ℃均可萌發，25 ℃為最佳，全光照條件及中性或略偏酸性條件更適宜分生孢子萌發。寧夏坐落于西北內陸、氣候干旱、日照時間長［37］，降水量少且集中于6-9月，該氣候特點與病原菌的生物學特性相吻合，可為田間確定防治時間提供依據。

4 結論

白粉菌侵染白三葉草葉片12 h 時附著胞一側形成侵染釘，侵入寄主組織形成吸器，被白粉病菌侵染的白三葉草葉片，表皮細胞的細胞壁被降解、氣孔通道變形，葉綠體腫脹，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多，顯示出白粉病菌侵染白三葉草破壞葉綠體的一種侵染機制，而白粉病菌實施了何種侵染策略有待于深入研究。依據傳統形態學特征，結合ITS 序列分析將寧夏地區白三葉草白粉病的致病菌鑒定為豌豆白粉菌。