瑞香狼毒根提取物對3種作物種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用

高玉蓮，常靜，王貽卉，李鋒，李海平*，馬崇勇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古 呼和浩特010020）

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）為瑞香科（Thymelaeaceae）狼毒屬（Stellera）多年生草本植物，民間又稱紅狼毒、饅頭花、綿大戟等，廣泛分布于我國干草原、沙質(zhì)草原和典型草原的退化草地上［1］。 瑞香狼毒全株有毒，是嚴重危害我國草原生態(tài)的毒雜草之一。與草原其他植物相比，瑞香狼毒對惡劣環(huán)境有更好的適應性，侵占性和競爭性也很強，這些特點使其在某一植物群落中更具競爭力，因此隨著草原的退化，瑞香狼毒成為群落中的優(yōu)勢種，與牧草爭奪空間和資源，牧草產(chǎn)量逐漸下降［2-3］。另外，瑞香狼毒還通過化感作用影響其他植物，對草地植物種的消長起重要作用［4-6］。據(jù)不完全統(tǒng)計，內(nèi)蒙古通遼市阿魯旗形成了以瑞香狼毒為主要植物群落的草場約4 萬hm2，有瑞香狼毒生長的草場約13.3 萬hm2，占全旗草場面積的28%［7］。在內(nèi)蒙古烏蘭察布草原，狼毒已經(jīng)成為退化草地的“景觀植物”。瑞香狼毒在甘肅省危害面積54.67 萬hm2，嚴重危害面積34.67 萬hm2，占全省毒草危害面積的31.12%［8］。近年來瑞香狼毒擴散面積和強度不斷增加，對畜牧業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)的危害日趨嚴重。張寶琛等［9］研究發(fā)現(xiàn)，植物間的化感作用可能是導致高寒草甸人工草場退化的重要原因。王文婷等［10］研究預測，未來氣候變化下高寒草地將成為未來狼毒擴散的主要區(qū)域。

瑞香狼毒的強侵占性和競爭性使其在草原上大肆蔓延，嚴重影響草原生態(tài)環(huán)境和畜牧業(yè)的發(fā)展。因其全株有毒，誤食易引起家畜中毒，目前主要采用人工挖除、化學滅除等方法防除瑞香狼毒，但這些防控方法又會造成水土流失、環(huán)境污染等問題。因此，合理利用瑞香狼毒、控制其發(fā)生蔓延在草原保護中就顯得尤為重要。化感作用（allelopathy）是植物種間關系的重要類型之一，關于瑞香狼毒的化感作用已有很多的研究成果，瑞香狼毒莖、葉、根系的分泌物和提取物均對其他植物的種子萌發(fā)和幼苗生長有不同程度的抑制作用［11-13］。但這些研究多集中在瑞香狼毒對草原主要牧草的化感作用上，若能利用瑞香狼毒化感作用的特性開發(fā)除草劑，對未來瑞香狼毒資源的合理開發(fā)利用將非常有利。一般測定植物之間化感作用常采用生物測定法，測定對象通常采用反應敏感、生長整齊的作物種，如黃瓜（Cucumis sativus）、油菜（Brassica campestris）、小麥（Triticum aestivum）、高粱（Sorghum bicolor）等［14］。因此，本研究選取了高粱、小麥、燕麥（Avena sativa）3 種禾本科作物，研究瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物種子萌發(fā)及幼苗生長狀況的影響，以及對3 種作物防御酶活性及丙二醛含量的影響，為未來合理利用瑞香狼毒資源，開發(fā)植物源除草劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物瑞香狼毒根于2018年8月采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗草原，取回洗凈陰干。受試作物高粱、小麥、燕麥種子，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 瑞香狼毒根提取物的制備 用小型粉碎機（永康紅太陽機電有限公司，浙江）將陰干的瑞香狼毒根粉碎后過0.425 mm 篩，按瑞香狼毒根粉末與70%乙醇比為1∶8 的比例加入乙醇，浸泡72 h 后過濾，將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海比朗儀器有限公司，上海）上，恒溫65 ℃蒸去大部分乙醇，將剩余提取物取出自然揮干至膏狀。保存在4 ℃冰箱備用。

1.2.2 瑞香狼毒根乙醇提取物對種子萌發(fā)的影響

采用培養(yǎng)皿濾紙法進行種子萌發(fā)試驗［15］。挑選飽滿、無蟲害的受試植物種子，用75%的乙醇、3%次氯酸鈉依次進行消毒，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，用濾紙吸干表面水分，置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑12 cm）中，每皿放置種子30 粒，分別加入不同濃度的瑞香狼毒根乙醇提取液5 mL（取少量乙醇溶解提取物后用蒸餾水將提取物分別稀釋為0.01、0.5、2.5、5、10 和25 mg·mL-1），以蒸餾水處理為對照，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為（25 ± 1）℃，每個濃度處理100 粒種子，3 次重復。每24 h 觀察記錄萌發(fā)種子數(shù)（胚根突破種皮1 mm 視為萌發(fā)），發(fā)芽末期連續(xù)2 d無萌發(fā)時視為發(fā)芽結(jié)束。根據(jù)慕小倩等［16］的方法計算發(fā)芽率。

發(fā)芽率=終期發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Williamson 等［17］提出的化感效應檢驗方法，即：RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T＜C)，其中C為對照值，T為處理值，RI為化感作用效應，RI＞0 為促進，RI＜0 為抑制，絕對值的大小表示作用強度大小。

化感綜合效應指數(shù)（synthetical effect of allelopathy，SE）反映化感效應的強弱，是指同一處理下對同一受體各測試項目（發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗高、根長）對照抑制百分率的算術平均值。

1.2.3 瑞香狼毒根提取物對作物幼苗生長的影響

作物幼苗生長至第8 天，各濃度處理分別取長勢良好的10 株幼苗進行莖、根長測量，每個處理記錄10 個測量值并求其平均數(shù)。測量時，以根與莖的交界處為起點，將尺子順著作物主莖量到生長點（頂部），即為幼苗的株高；以根與莖的交界處為起點，一直到主根最底端，即為幼苗主根根長；根莖長測量均重復3 次。

1.2.4 幼苗生理指標的測定 1）丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定：參照李合生［18］實驗方法。取0.5 g 葉片，加5%三氯乙酸（TCA）5 mL，研磨后所得勻漿在3000 r·min-1下離心10 min。取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后在100 ℃水浴上煮沸30 min，冷卻后再離心一次。分別測定上清液在450、532 和600 nm 處的吸光度值，并按公式算出MDA 濃度，再算出單位鮮組織中的MDA 含量，單位為mmol·g-1FW。

2）過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法［18］。取0.5 g 葉片加入5 mL 磷酸緩沖液（pH 7.0，0.1 mol·L-1），冰浴下碾磨勻漿，勻漿液于4 ℃5000 r·min-1離心15 min，上清液即為POD 粗酶液。吸取0.1 mL 酶液加入2.5 mL 愈創(chuàng)木粉-H2O2混合溶液，于470 nm 下測量吸光度。每隔30 s 讀一次，連續(xù)讀3 min，以磷酸緩沖液（PBS）替代粗酶液作為空白對照。以吸光度每分鐘變化0.10 為一個活力單位，單位為U·g-1·min-1。

3）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定：采用NBT 法［18］。取0.5 g 葉片加入5 mL PBS（pH 7.8，0.05 mol·L-1），冰浴碾磨后于4 ℃10000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。在試管中加入甲硫氨酸（Met）（終濃度為13 mmol·L-1）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）（終濃度為10 μmol·L-1）、氮藍四唑（NBT）（終濃度為75 μmol·L-1）、核黃素（終濃度為2 μmol·L-1）和酶液并定容至3 mL，另取2 支對照管以緩沖液代替酶液。將上述對照管和1 支測定管置于4000 lx 光照下反應20 min。用遮光的對照管為空白對照。以NBT為底物，以抑制NBT 光化還原50%為一個酶活性單位，單位為U·g-1FW·h-1。

4）過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定：采用紫外吸收法［18］。取0.5 g 葉片加入5 mL PBS（pH 7.0，0.05 mol·L-1），冰浴下碾磨勻漿，勻漿液于4 ℃15000 r·min-1離心15 min，上清液即為CAT 粗酶液。在3 mL 反應體系中，按一定比例加入Tris-HCl 緩沖液、蒸餾水以及酶液，之后在25 ℃水浴中預熱3 min 后，逐管加入0.2 mL 200 mmol·L-1H2O2溶液，于470 nm 下測量吸光度。每隔30 s 讀一次，連續(xù)讀3 min，以PBS 替代粗酶液作為空白對照，以1 min 內(nèi)A240降低0.10 為一個酶活性單位（U），單位為U·g-1FW·min-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用軟件SPSS 20.0 對試驗數(shù)據(jù)進行方差比較和顯著性分析，其顯著水平設P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑞香狼毒根乙醇提取物對不同作物種子發(fā)芽的影響

在瑞香狼毒根乙醇提取物不同濃度作用下，高粱種子發(fā)芽率均低于對照，但差異不顯著。瑞香狼毒根乙醇提取物濃度為25 mg·mL-1時，小麥種子的發(fā)芽率與對照相比差異顯著，其余濃度下差異均不顯著。瑞香狼毒根乙醇提取物對燕麥種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)“低促高抑”的濃度效應，但與對照相比差異不顯著（表1）。

表1 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of ethanol extracts from S.chamaejasme root on seed germination of three crops

2.2 瑞香狼毒根乙醇提取物對不同作物幼苗生長的影響

隨著瑞香狼毒根乙醇提取液濃度的增加，高粱根長與莖長呈現(xiàn)“低促高抑”的濃度效應。當提取液濃度為0.01 mg·mL-1時，與對照相比根長促進了14.01%，差異顯著；其余濃度下高粱根長受到抑制。當提取液濃度為0.5、0.01 mg·mL-1時，高粱莖長分別增加了8.84%和9.76%，但與對照差異不顯著，而其余濃度下莖長受到抑制，與對照及低濃度之間差異顯著（圖1）。

圖1 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物根莖長的影響Fig.1 Effects of ethanol extract from S.chamaejasme root on root and stem length of three crops

不同濃度瑞香狼毒根乙醇提取液對小麥根、莖長度均起到抑制作用，濃度越大抑制程度越強。濃度為0.01 mg·mL-1時對小麥根莖長抑制作用最弱，較對照降低了9.34%和16.72%。濃度為25 mg·mL-1時對小麥根莖長抑制作用最強，抑制率為92.49%和73.10%。

當瑞香狼毒根乙醇提取液濃度為0.01 和0.5 mg·mL-1時，對燕麥根莖長有促進作用；而其他濃度對燕麥根莖長均產(chǎn)生了抑制作用，濃度越大抑制越強。在濃度25 mg·mL-1時產(chǎn)生的抑制作用最大，抑制率為93.13%和60.65%，總體呈現(xiàn)出“低促高抑”的濃度效應。

2.3 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種禾本科作物化感綜合效應的影響

為了綜合分析瑞香狼毒根乙醇提取液對3 種禾本科作物種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的化感效應，統(tǒng)計3 種植物的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗根長、幼苗莖長6 個指標的化感效應指數(shù)，計算出化感綜合效應指數(shù)（表2）。隨著瑞香狼毒根乙醇提取液濃度的升高，高粱、燕麥表現(xiàn)為“低促高抑”的雙重效應，濃度為0.01 和0.5 mg·mL-1時對高粱、燕麥表現(xiàn)為促進作用，高于0.5 mg·mL-1時表現(xiàn)為抑制作用；二者均隨著濃度的升高抑制作用逐漸增強。瑞香狼毒根乙醇提取物對小麥表現(xiàn)出抑制作用，濃度越大抑制程度越強。在瑞香狼毒根乙醇提取液濃度范圍內(nèi)（0.01～25 mg·mL-1），對3 種禾本科作物的抑制作用強弱順序為：小麥＞燕麥＞高粱。

表2 瑞香狼毒根提取物對3 種作物的化感綜合效應Table 2 Allelopathy of S.chamaejasme root extract on three crops

2.4 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物幼苗丙二醛（MDA）含量的影響

瑞香狼毒根乙醇提取液對3 種作物MDA 含量的影響（圖2）。瑞香狼毒根乙醇提取液處理后，高粱MDA 含量增加，提取液濃度為5、10 mg·mL-1時MDA 含量與對照有顯著差異。在濃度為5 mg·mL-1時，小麥MDA 含量顯著高于對照，濃度為0.01、25 mg·mL-1時，小麥MDA 含量顯著低于對照，其余處理與對照無顯著差異。提取液處理后燕麥MDA 含量增加，不同濃度處理與對照相比均有顯著差異。

圖2 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on malondialdehyde（MDA）content in three crops

2.5 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物幼苗過氧化物酶（POD）活性的影響

瑞香狼毒根乙醇提取液處理使3 種作物體內(nèi)POD 活性較對照均有不同程度的升高。高粱幼苗中POD 活性隨濃度的增大而升高，在濃度為10 mg·mL-1時POD 活性最高，比對照增大了116.29%。小麥幼苗中POD 活性在0.01、0.5 和10 mg·mL-1下與對照差異顯著，其余濃度下的POD 活性與對照均無顯著差異；不同濃度處理燕麥幼苗中POD 活性均顯著高于對照，在濃度為0.01 mg·mL-1時POD 活性最大（圖3）。

圖3 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物過氧化物酶活性的影響Fig.3 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on peroxidase（POD）activity in three crops

2.6 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

加入瑞香狼毒根乙醇提取液處理后，高粱SOD 活性增加，但與對照無顯著差異。小麥SOD 活性在提取液高濃度（10 和25 mg·mL-1）處理下顯著高于對照，其他處理與對照無顯著差異。在提取液濃度為0.01 mg·mL-1時，燕麥SOD 活性顯著高于對照，其余濃度與對照無顯著差異（圖4）。

圖4 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物超氧化物歧化酶活性的影響Fig.4 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on superoxide dismutase（SOD）activity in three crops

2.7 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物過氧化氫酶（CAT）活性的影響

瑞香狼毒根乙醇提取液對3 種作物體內(nèi)CAT 活性的影響（圖5）。加入提取液后，3 種作物體內(nèi)CAT 活性均低于對照。處理濃度為25 mg·mL-1時，3 種作物CAT 活性均最低，分別為對照的0.33、0.31、0.37 倍，與對照存在顯著差異（圖5）。

圖5 瑞香狼毒根乙醇提取物對3 種作物過氧化氫酶活性的影響Fig.5 Effect of ethanol extract from S.chamaejasme root on catalase（CAT）activity in three crops

3 討論

化感作用普遍存在于自然界，是植物長期自然選擇的結(jié)果，也是植物提高自身生存能力的重要手段之一，其在優(yōu)勢種的形成、群落演替、植被恢復中起著重要的作用［19］。研究表明，植物化感作用的強度與浸提液濃度、化感物質(zhì)種類及受試植物種類有關［20］。

植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中，可抑制或促進自身或其他植物各個階段的生長發(fā)育［21］。種子萌發(fā)對物種更新至關重要，種子發(fā)芽率降低會使植物的競爭力減弱，影響植物在自然群落中的多度，進而影響群落結(jié)構，最終導致生態(tài)系統(tǒng)退化［22-23］。本研究中，瑞香狼毒不同濃度提取物降低了高粱種子的萌發(fā)率，但與對照相比均不顯著，此結(jié)論與馮娜［24］研究狼毒葉提取物對黍子（Panicum miliaceum）萌發(fā)影響的結(jié)果一致。瑞香狼毒提取物在低濃度時促進了小麥和燕麥種子的萌發(fā)率，但不顯著，隨著濃度的升高逐漸抑制了種子的萌發(fā)率，這一結(jié)論與劉雅婧等［13］在研究狼毒浸提液對3 種牧草種子萌發(fā)的影響中得出的結(jié)論相符。說明不同受試植物的種子對狼毒提取液的敏感性不同，狼毒對3 種受體作物的化感作用具有物種選擇性及濃度依賴性［25］。

幼苗階段對于植物生長至關重要，植物在幼苗階段從外界充分吸收營養(yǎng)物質(zhì)供生存和繁衍。季麗萍［11］的研究表明，高濃度瑞香狼毒根水浸液對紫花苜蓿（Medicago sativa）、黑麥草（Lolium perenne）的株高和根長有明顯抑制作用，且根長較株高受抑制作用更大。本研究也有相似結(jié)論，瑞香狼毒提取液低濃度處理促進了高粱、燕麥的根長和莖長，高濃度下抑制；小麥隨著提取液濃度的升高，根、莖長的抑制作用逐漸增大。這些結(jié)論表明，瑞香狼毒浸提液中的某些化感物質(zhì)對受試植物向外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生了阻礙，從而影響受試植物的幼苗生長。且相同濃度浸提液對根長的抑制作用明顯大于莖長，造成這一現(xiàn)象的原因，Turk 等［26］和Chon 等［27］認為，植物根系直接接觸到浸提液，受到化感抑制的時間更長，而葉片靠根部運輸養(yǎng)分，只有當根系受到化感脅迫到一定程度時，葉片才會表現(xiàn)明顯的響應。

一般來說，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除之間處于動態(tài)平衡。逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，此時保護酶活性增強或維持較高的水平，才能清除活性氧自由基，使之維持較低的水平，防止自由基對生物膜結(jié)構和功能的破壞［28］。丙二醛（MDA）是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其含量高低指示膜脂過氧化強度和膜系統(tǒng)的受損程度。本研究表明，在瑞香狼毒根提取物的作用下，受試作物MDA 含量隨著提取液濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，幾乎均高于對照，說明受試作物體內(nèi)發(fā)生的膜脂過氧化程度強，植物受損程度大，與黃建貝等［29］、曹成有等［30］的研究結(jié)果一致。高粱、燕麥在濃度為10 mg·mL-1時MDA 含量達到最高，小麥在濃度為5 mg·mL-1下MDA 含量達到最高，隨后作物體內(nèi)MDA 含量下降，這可能是由于高濃度逆境脅迫已使植物受到傷害，無法逆轉(zhuǎn)［31］。過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是抗氧化酶系統(tǒng)中控制植物體內(nèi)活性氧積累最主要的酶，對維護植物的正常生長具有保護作用［32］。本試驗中，瑞香狼毒根提取液處理受試作物后，3 種作物幼苗POD 活性均高于對照，與李翔等［33］在黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala）水提液對燕麥的化感作用及其機理研究中所得結(jié)果相符。POD 活性的增加一方面有利于清除體內(nèi)的活性氧，另一方面參與細胞壁多種結(jié)構成分的聚合，使植物細胞伸展性下降，從而限制植物細胞伸長［34］。高粱、小麥幼苗中SOD 活性隨提取液濃度增大逐漸升高，這可能是因為在瑞香狼毒根乙醇提取液處理下，抗氧化酶活性升高作為其體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加的一種應急機制；而燕麥幼苗中SOD 活性在低濃度下促進，高濃度下抑制，這可能是在高濃度處理下，受體作物體內(nèi)的ROS 代謝失調(diào)，從而導致抗氧化酶活性降低［35］，這與張金羽等［36］的研究結(jié)果相似。黃建貝等［29］在核桃（Juglans regia）凋落葉對小麥的影響中發(fā)現(xiàn)，隨著凋落葉濃度的增加小麥體內(nèi)CAT 活性顯著低于對照，本試驗中，瑞香狼毒根提取液處理后3 種作物幼苗CAT 活性均低于對照，與他們的結(jié)論一致。

瑞香狼毒是退化草原上重要的多年生毒雜草，隨著草原生態(tài)環(huán)境的惡化有不斷蔓延擴散的趨勢，對草原生態(tài)系統(tǒng)影響極大。本研究通過其對3 種指示作物種子發(fā)芽、幼苗生長的影響及其影響機制的研究，為未來合理利用瑞香狼毒、開發(fā)植物源除草劑提供一定的科學依據(jù)。利用瑞香狼毒對其他植物的化感作用將其開發(fā)成新型的植物源除草劑，不僅可以節(jié)約草原毒害草的治理成本，還可以減少水土流失，有效遏止草原荒漠化的蔓延趨勢，提高草原生態(tài)的恢復能力。對提升當?shù)厝鹣憷嵌举Y源的有效利用，變害為利、變廢為寶，改善生態(tài)環(huán)境具有重要的意義。