箭筈豌豆種植密度對土壤微生物養分代謝的影響

周詩晶，羅佳寧，劉仲淼，董超，秦燕，吳淑娟，甘紅軍，謝菲，莊光輝，伏兵哲，牛得草*

（1.草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，蘭州大學草業科學國家級實驗教學示范中心，甘肅 蘭州730020；2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海省畜牧獸醫科學院，青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室，青海 西寧810016；3.內蒙古自治區阿拉善盟林業草原和種苗工作站，內蒙古 巴彥浩特750306；4.寧夏大學農學院，寧夏 銀川750021）

陸地生態系統中，植物與土壤間關系密切，植物生長特征的變化勢必影響土壤養分的轉化及肥力發展過程［1］，且土壤微生物作為聯系土壤和植物的重要因素［2］，植物同土壤微生物之間存在強烈的交互作用，共同驅動著土壤養分的循環過程［3］。豆科（Leguminosae）植物作為植物界特殊的功能類群，能與環境中的固氮微生物共生形成根瘤菌，通過自身固氮作用吸收空氣中的氮素，從而為土壤源源不斷地提供氮源，另外，豆科植物能夠積累較多的有機物（如生物量、根系分泌物），降低土壤對磷的吸附和富集作用，活化土壤中難以被利用的碳（C）、氮（N）和磷（P）等養分［4-5］，從而提升土壤肥力［6-7］。此外，豆科植物對土壤養分的選擇性吸收反過來也影響到土壤養分的供給比例及總量，進而影響微生物的食物資源特征。土壤中有機養分的礦化主要由非共生的土壤微生物生長代謝所驅動［8-9］，土壤微生物胞外酶的合成與釋放被視為土壤微生物的一種覓食策略，為適應環境資源供應特征的改變，微生物將通過調整養分活化關鍵酶的分泌過程及其計量比，來增加限制性元素的獲取能力，從而來保證生物體內較強的化學計量內穩態［10-11］。土壤微生物胞外酶化學計量學是生態化學計量理論與生態學代謝理論的交叉，可以提高關于能量和養分束縛微生物代謝過程的認識［12］。近年來，許多學者對不同利用方式的土壤微生物養分代謝特征［13-15］進行了相關研究。楊文航等［15］研究表明，種植狗牙根（Cynodon dactylon）能提高土壤營養元素周轉率及土壤微生物生物量。然而，目前關于豆科種植對土壤微生物的養分需求和養分代謝的影響過程仍然不是很清楚，限制了對土壤微生物驅動養分循環過程和機理的認識。

一年生豆科植物箭筈豌豆（Vicia sativa）是優質牧草，因為其生育周期短，對土壤和氣候適應性較強，具有較強的固氮吸碳、改善土壤結構等功能，常作為綠肥植物，在土壤培肥及輪作倒茬等農藝措施管理中廣為應用［16-17］。本研究以箭筈豌豆為例，采用盆栽試驗，分別設置低密度組（19 株·盆-1）、高密度組（40 株·盆-1）和對照組（空白）處理，通過分析不同密度條件下種植箭筈豌豆的植物生物量及養分、土壤養分、土壤微生物生物量碳氮磷及其計量比和土壤酶活性等指標，研究種植箭筈豌豆對土壤養分及微生物養分代謝特征的影響，以便深入理解豆科植物與微生物的養分互作過程，并為土壤培肥及栽培草地的建植管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區基本概況

試驗在蘭州大學榆中草地農業生態系統實驗站開展，該區屬于典型溫帶大陸性季風氣候，冬季干燥，夏季多風，晝夜溫差較大，年平均氣溫10.3 ℃，年均降水量350 mm，雨季主要集中在6-9月，蒸發量1450 mm，年平均日照2446 h，無霜期約180 d，土壤類型為灰鈣土。

1.2 試驗設計

本研究為盆栽試驗，供試土壤采自蘭州大學榆中校區萃英山下農田耕作土壤，土壤養分含量如下：土壤有機質5.52 g·kg-1，全氮0.40 g·kg-1，全磷0.76 g·kg-1，速效磷3.40 mg·kg-1。

2019年6月10日，將混合均勻的土壤裝入花盆，花盆高度20 cm，半徑10 cm，土壤為3.5 kg，共計15 盆，花盆置于蘭州大學榆中草地農業生態系統實驗站試驗地內，隨機擺開。澆水至飽和，置放一周后，進行播種。

2019年6月17日，對花盆內土壤表層進行松土，隨機選10 盆，各播入100 粒箭筈豌豆種子，淺覆土，所有花盆澆適量的水，待植物出苗2～3 cm 后，進行間苗工作，分別設置低密度組（5 盆）和高密度組（5 盆）及對照（5 盆）。低密度組為每盆內植株間苗至19 株，高密度組為每盆內植株間苗至40 株，對照組不種植。培養期間，適時澆水。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 樣品采集 2019年8月17日將箭筈豌豆分地上部和根兩部分進行采集，分別稱鮮重后，在105 ℃下殺青30 min，再于65 °C 烘箱中烘干至恒重；后采集土壤樣品，剔除植物殘體等肉眼可見的雜物，用四分法去除多余土樣后過2 mm 篩。一部分土樣自然風干，用于測定土壤有機碳、全氮、全磷含量；另一部分裝入密封袋，儲存于4 ℃冰箱中，用于測定土壤可溶性碳氮磷養分、土壤微生物生物量碳氮磷含量和土壤酶活性。

1.3.2 測定方法 1）植物養分的測定：取烘干的植物樣品用冷凍混合球磨儀將樣品粉碎，過0.150 mm 篩。采用碳氮元素分析儀測定植物樣品中碳和氮含量，采用HClO4-H2SO4消化-鉬銻抗比色法（紫外分光光度計UV-1600）測定植物樣品中的磷含量［18］。

2）土壤養分的測定：土壤有機碳（soil organic carbon，SOC）采用重鉻酸鉀氧化法測定［19］；土壤全氮（total nitrogen，TN）采用半微量凱氏滴定法測定［20］；土壤全磷（total phosphorus，TP）采用HClO4-H2SO4消化-鉬銻抗比色法測定［18］。可溶性有機碳和總氮用2 mol·L-1KCl浸提，采用TOC-TN分析儀（Liqui TOC II，Elementar，德國）測定［21］；可溶性無機磷用0.5 mol·L-1NaHCO3萃取，在pH 8.5 下，采用鉬酸鹽-抗壞血酸法比色法（UV-1601，Shimadzu Inc.，日本）測定［18］。

3）土壤微生物生物量碳氮磷含量的測定：土壤微生物生物量碳（soil microbial biomass carbon，SMBC）、土壤微生物生物量氮（soil microbial biomass nitrogen，SMBN）和土壤微生物生物量磷（soil microbial biomass phosphorus，SMBP）的測定采用氯仿熏蒸－浸提法［22］。即將土樣分成兩份子樣品，一份用2 mol·L-1K2SO4提取碳和氮，和0.5 mol·L-1pH 8.5 的NaHCO3提取磷。SMBC、SMBN 和SMBP 的含量通過計算熏蒸樣品中元素的含量與未熏蒸樣品中元素的含量的差值除以轉換系數KE（熏蒸殺死的微生物體內C、N 和P 被浸提出來的比例）得到，SMBC、SMBN 和SMBP 的KE 分別為0.45、0.54 和0.40［23］。

4）土壤酶活性：采用對硝基酚（ρNP）底物分光光度法［24］測定4 種水解酶的活性，包括β-1，4-葡糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG，C-獲取酶），β-1，4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-1，4-N-acetylglucosaminidase，NAG，N-獲取酶），亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，LAP，N-獲取酶）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP，P-獲取酶）。

1.4 數據分析與處理

采用Sigmaplot 14 軟件作圖，采用SPSS 24.0 進行統計分析，多重比較用One-Way ANOVA（單因素方差分析）進行檢驗（P＜0.05）。圖表中的數據均為平均值±標準誤，誤差線為標準誤。

2 結果與分析

2.1 箭筈豌豆的生物量及養分含量的變化

由圖1可知，提高種植密度，箭筈豌豆地上組織C 和N 含量無明顯變化，僅P 的含量較低密度組顯著降低28.6%，最終，高密度組箭筈豌豆地上組織C∶P 和N∶P 較低密度組分別顯著增加29.7%和21.0%，結果表明提高種植密度對箭筈豌豆地上組織C∶N 無顯著影響。

圖1 不同種植密度箭筈豌豆地上組織碳氮磷養分含量及計量比特征Fig.1 Contents of C，N and P and their mass ratios in the above ground biomass of V.sativa planted with different densities

種植密度對箭筈豌豆的生物量和碳、氮、磷養分積累量的影響表現出一致的規律性（表1），即與低密度組相比較，高密度組箭筈豌豆整體（每盆）地上、地下及總生物量和整體（每盆）碳、氮、磷養分積累量均增加顯著，而單株水平植物生物量和碳、氮、磷養分積累在各處理間無顯著差異。對于箭筈豌豆的養分積累總量C∶N、C∶P 和N∶P 計量比，種植密度的改變均對其影響不顯著。總體而言，箭筈豌豆種植密度的增加提高了植物生物量及從環境中吸收碳、氮、磷養分總量，但對單株植物生物量和碳、氮、磷養分總量及養分計量比無顯著影響。

表1 不同種植密度箭筈豌豆的生物量與養分積累量Table 1 Biomass and C，N and P accumulation in V.sativa planted with different densities

2.2 土壤養分的變化

種植不同密度的箭筈豌豆顯著提高了土壤有機碳含量（表2），與空白對照組相比，低密度和高密度箭筈豌豆土壤有機碳分別提高了25.1%和20.9%，且高密度組與低密度組間無顯著差異，土壤全氮含量在各處理間均無顯著差異，種植箭筈豌豆對土壤全磷的影響，低密度組和對照相比無顯著區別，但均顯著高于高密度組。種植不同密度箭筈豌豆對土壤可溶性有機碳和可溶性總氮含量無顯著影響，且與對照相比也無顯著差異，但是，種植高密度箭筈豌豆土壤可溶性無機磷含量與對照組相比顯著降低31.0%，而低密度組與對照組間相比無顯著差異。相比對照組，種植箭筈豌豆對土壤可溶性養分計量比RC：N、RC：P、RN：P的影響不顯著，且不同種植密度間土壤可溶性養分計量比也不存在顯著差異。

表2 不同種植密度土壤的養分含量Table 2 Nutrient content of soil under different planting densities

2.3 土壤微生物生物量碳氮磷含量及其計量比的變化

種植不同密度箭筈豌豆對土壤微生物生物量碳氮含量影響較顯著（表3），其中高密度組SMBC 含量顯著高于低密度組和對照組，SMBN 含量表現出高密度組＞低密度組＞對照組，其低密度組、高密度組SMBN 含量較對照組分別顯著增加71.9%和164.7%，種植不同密度箭筈豌豆對SMBP 含量無顯著影響。分析土壤微生物生物量碳氮磷計量比發現：高密度和低密度組箭筈豌豆較對照顯著降低了SMBC∶SMBN，但不同種植密度間無顯著差異，且不同種植密度對SMBC∶SMBP、SMBN∶SMBP 無顯著影響。

表3 不同種植密度下土壤微生物生物量碳氮磷含量及其計量比Table 3 Soil microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus and stoichiometric ratios under different planting densities

2.4 土壤酶活性的變化

種植箭筈豌豆顯著改變了土壤微生物碳氮磷獲取酶活性及其計量比（圖2）。種植不同密度箭筈豌豆顯著降低了土壤中β-1，4-葡糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG，C-獲取酶）活性，其中低密度組、高密度組土壤BG 酶活性較對照組分別降低37.4%、52.0%，且高密度組土壤BG 酶活性低于低密度組；土壤中β-1，4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-1，4-N-acetylglucosaminidase，NAG，N-獲取酶）和亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，LAP，N-獲取酶）活性隨種植密度增加而增加，其中高密度組（NAG+LAP）酶活性顯著高于對照組，是對照土壤的1.38 倍；種植箭筈豌豆顯著提高了堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP，P-獲取酶）活性，但不同種植密度間無顯著差異。

圖2 不同種植密度土壤酶活性及其計量比的變化Fig.2 Changes of the soil enzymatic activities and stoichiometric ratios on different planting densities

種植箭筈豌豆后，土壤BG∶（NAG+LAP）、BG∶AP、（NAG+LAP）∶AP 均顯著降低，其中低密度組和高密度組的BG∶（NAG+LAP）之間差異顯著，較對照組分別降低41.4%和64.4%。種植密度對BG∶AP 和（NAG+LAP）∶AP 無顯著影響，不過，低密度組和高密度組土壤BG∶AP 較對照組分別降低78.8%和83.1%，低密度組和高密度組（NAG+LAP）∶AP 較對照組分別降低59.8%和48.7%。

3 討論

3.1 不同密度箭筈豌豆生物量及養分吸收利用特征

植物的養分含量反映了植物的養分狀態及其對養分的需求，與其生境的土壤養分有效性高度相關，并隨土壤養分有效性的增加而增加［25-26］，反映了土壤提供養分的能力［27］。本研究中不同種植密度對箭筈豌豆地上組織碳氮養分含量無顯著影響（圖1），表明碳氮并未對植物生長起到限制作用，一方面是由于箭筈豌豆固氮能力強，另一方面當前的高密度處理（40 株·盆-1）下，箭筈豌豆生長還未對氮素營養供應特征產生密度制約效應。本研究中高密度處理箭筈豌豆地上組織磷養分含量較低密度組顯著降低28.6%，表明植物生長受到土壤磷素供應不足的限制。Koerselman 等［28］的研究表明，植物地上組織N∶P 能夠作為植物生長受土壤有效性N 和P 相對限制狀況的診斷指標，N∶P＜14 時，植物表現為受N 限制；N∶P＞16 時，植物表現為受P 限制；N∶P 介于14 和16 之間時，植物表現為受N 和P 共同限制。本研究結果中，低密度組與高密度組箭筈豌豆地上組織N∶P 分別為14.65 和17.73，表明隨種植密度的增加箭筈豌豆生長由氮磷共限制逐漸轉向受P 的強烈限制。

本研究結果顯示，箭筈豌豆單株生物量和養分積累量無顯著變化，而高密度組的整體（每盆）生物量和養分積累量均高于低密度組（表1），表明提高種植密度增強了箭筈豌豆的群體效應，表現為生物量的增加及從環境中吸收的碳氮磷等養分增加，而高密度處理（40 株·盆-1）還未對箭筈豌豆生長產生明顯的密度制約效應。

3.2 種植箭筈豌豆對土壤養分的影響

良好的土壤環境是草地可持續發展的重要條件，由于植物-土壤間關系密切，因此地上植物的變化勢必影響地下土壤養分特征［1］。土壤有機碳作為土壤的重要組成部分，直接影響土壤水分、養分和植被以及土壤生物之間的關系，在土壤肥力、生態系統生產力中扮演著重要角色［29-31］。植物通過光合作用固定的碳，有20%～50%以植物根系分泌物與死亡的形式輸入土壤［32］。土壤氮素和磷素在植物生長、微生物生長和活性以及生態系統功能的發揮中也起著重要作用，是影響植物生長的重要元素［29-31］。與碳的固定類似，豆科植物可以通過共生固氮，從環境中獲得外源的氮素資源，以提高植物-土壤系統氮素的積累，而磷素屬于沉積型循環，只是存在植物與土壤系統內部各組分庫的轉移［33-34］。本研究中，種植不同密度箭筈豌豆顯著增加了土壤有機碳含量，但并未改變土壤全氮含量，土壤中氮素的固定與釋放處于平衡狀態，而土壤全磷含量僅在高密度組顯著降低，主要是土壤磷元素向植物體內積累的緣故。本研究表明，種植不同密度的箭筈豌豆一定程度上提高了土壤養分含量，有利于草地的可持續發展。

可溶性有機碳、可溶性總氮和可溶性無機磷是土壤微生物從環境獲取能量與物質的有效形態［35-36］。本研究顯示，種植箭筈豌豆以及不同種植密度對可溶性有機碳和可溶性總氮含量影響不明顯，而在高密度組可溶性無機磷顯著降低，表明當前箭筈豌豆種植處理，改變了環境中土壤微生物磷素營養的有效性，且高密度組箭筈豌豆生長與微生物代謝對土壤磷素的需求存在強烈的競爭。土壤中可溶性養分計量比影響土壤微生物的生命活動，因為土壤微生物既需要碳素提供能量，又需要氮、磷素投資作為自身的組成成分［37］。例如，當土壤RC：N較高時，土壤微生物需要輸入氮來滿足它們的生長，反之，在RC：N較低時，過量的氮會被土壤微生物排泄到土壤中［38］。本研究中，種植箭筈豌豆對土壤可溶性養分計量比RC：N、RC：P、RN：P的影響不顯著，且不同種植密度間土壤可溶性養分計量比也無顯著差異，主要是由于可溶性有機碳、可溶性總氮受箭筈豌豆種植密度的影響表現出與可溶性無機磷相似的降低趨勢，表明隨箭筈豌豆種植密度增加，土壤中有限的可溶性總氮供應量可能也限制土壤微生物代謝，不過磷素限制更為強烈。

3.3 種植箭筈豌豆對土壤微生物量養分及土壤酶活性的影響

土壤微生物是土壤碳氮磷養分釋放或固持的重要調節者［39-40］，土壤微生物量碳含量通常表示土壤中微生物的多少［41］，且土壤微生物C∶N∶P 計量比能反映其對養分的相對需求程度［42］。本研究中高密度組箭筈豌豆SMBC含量為194.42 mg·kg-1，顯著高于對照組和低密度組，且SMBN 含量表現出高密度組＞低密度組＞對照組，表明高密度組處理促進了土壤微生物的繁殖，這是因為種植箭筈豌豆增加了植物向土壤輸入的C 和N 的量，如根系分泌物等［30-31，43］，與SMBC 和SMBN 不同，種植不同密度箭筈豌豆對SMBP 含量無顯著影響，且表現出隨種植密度增加先降低后升高的規律。目前對于SMBP 含量受種植密度影響的研究較少，可能由于不同植物所需的磷含量不同而對種植密度產生不同響應，本研究中由于植物與土壤微生物對土壤養分資源存在競爭，尤其無法獲得外源磷的輸入，最終，土壤中磷素相對缺乏，SMBP 含量降低，高密度組箭筈豌豆地上組織的磷含量及N：P（＞16）也證實土壤磷素供應不足。本研究中，種植箭筈豌豆較對照顯著降低了SMBC∶SMBN，且不同處理對SMBC∶SMBP和SMBN∶SMBP 影響不顯著，表明種植箭筈豌豆后土壤微生物對氮素的相對需求量增加，很可能與土壤微生物群落結構的改變有關，通常細菌較真菌具有較高的氮素含量［44］，進一步暗示，種植箭筈豌豆后土壤中細菌比例顯著增加，不過，還有待于進一步的試驗驗證。

土壤酶是一種具有生物催化能力和蛋白質性質的高分子活性物質，其中土壤水解酶的種類很多，以土壤微生物胞外酶占主導［45-46］。本研究所選擇的4 種酶類（BG 酶、LAP 酶、NAG 酶和AP 酶）是土壤C、N 和P 轉化的末端水解酶，與微生物養分代謝關系密切［13，46］。土壤微生物通過響應環境信號（例如低的養分可利用性）進行酶的生物合成，進而滿足微生物養分需求［12，46］。土壤酶活性及其化學計量比能夠很好地反映微生物生長過程中土壤養分有效性和土壤微生物對碳、氮、磷養分需求的變化［47］。本研究結果顯示，種植箭筈豌豆后土壤BG 酶活性降低，而土壤（NAG+LAP）酶和AP 酶活性均增加，且土壤BG∶AP 和（NAG+LAP）∶AP 均低于對照組，BG∶（NAG+LAP）表現為對照組＞低密度組＞高密度組，上述結果表明，種植箭筈豌豆后土壤微生物增加了氮獲取酶（NAG+LAP）和磷獲取酶（AP）的分泌量，尤其是磷獲取酶較對照顯著增加，土壤酶活性及計量比的表現特征與土壤可溶性養分含量相配套，進一步支持土壤微生物生長受到了土壤中氮磷資源的限制。

4 結論

1）箭筈豌豆種植密度的增加提高了整體植物生物量，并增加環境中的養分吸收總量，導致植物生長由氮磷共限制逐漸轉向受磷的強烈限制；2）種植箭筈豌豆對土壤可溶性無機磷和總氮含量的影響大于可溶性有機碳，但對土壤可溶性養分計量比RC：N、RC：P、RN：P的影響不顯著；3）種植箭筈豌豆對SMBN 和SMBC 含量影響顯著，且土壤微生物增加了氮獲取酶（NAG+LAP）和磷獲取酶（AP）的分泌量，致使碳氮磷獲取酶計量比變化顯著。