磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿幼苗根系生長(zhǎng)和生理特征的影響

王如月，袁世力，文武武，周鵬，安淵

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科多年生草本植物，適口性好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富有“牧草之王”的美稱(chēng)。紫花苜蓿在我國(guó)的栽培歷史長(zhǎng)達(dá)兩千多年，近年來(lái)隨著我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)模和水平的不斷提高，紫花苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，主要種植在北方地區(qū)，南方種植面積相對(duì)較小。究其原因主要是南方土壤多呈強(qiáng)酸性［1］，而紫花苜蓿適宜生長(zhǎng)在弱酸性環(huán)境（6.5～7.5）中，當(dāng)土壤pH 小于4.5 時(shí)，紫花苜蓿的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，從而限制了紫花苜蓿在南方大面積種植。李劍峰［2］的研究表明，如果單純考慮土壤酸度，紫花苜蓿適宜生長(zhǎng)的pH 為5。由此可看出，酸性土壤中影響紫花苜蓿生長(zhǎng)的因素不僅僅是pH，還有其他更重要的因素。鋁（Al）在地殼中的含量?jī)H次于氧和硅，是含量最豐富的金屬元素，占地殼總量的7.5%［3］。一般情況下，土壤中的鋁以鋁硅酸鹽化合物或氧化物的形態(tài)存在［4］，植物難以吸收。當(dāng)土壤pH 值低于5.5 時(shí)，固相態(tài)鋁釋放到土壤中以交換性鋁離子的形態(tài)存在［5］，從而對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。鋁對(duì)植物的傷害是多方面的，典型的特征是根伸長(zhǎng)和根毛形成受到抑制［6］，從而降低根系吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，導(dǎo)致光合作用減弱，影響植物生長(zhǎng)［7］。酸性土壤中Al3+濃度的增加會(huì)與其他陽(yáng)離子競(jìng)爭(zhēng)根表面質(zhì)膜的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，間接造成植物營(yíng)養(yǎng)缺乏［8］。有研究發(fā)現(xiàn)鋁可以抑制黑麥（Secale cereale）、小麥（Triticum aestivum）［9］根系對(duì)磷的吸收，導(dǎo)致缺磷癥的發(fā)生。原因是鋁離子易與土壤中的磷形成不溶于水的AlPO4，從而降低土壤溶液中的磷含量［10］。磷（phosphorus，P）是植物生長(zhǎng)發(fā)育的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一［11］，在酸性土壤中經(jīng)常施用磷肥，以增加土壤中磷的有效性，降低鋁的毒性，例如磷能夠緩解水稻（Oryza sativa）［12］、油茶（Camellia oleifera）［13］等的鋁毒害，但也有研究認(rèn)為鋁脅迫下水稻根系分泌磷酸鹽并不能緩解鋁對(duì)水稻的毒害［14］。磷緩解植物鋁毒害的作用可能因物種和栽培方式的不同而不同。

我國(guó)長(zhǎng)江以南的酸性土壤地區(qū)有著適宜的溫度和充足的水分，可為牧草生長(zhǎng)提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，研究紫花苜蓿對(duì)酸鋁環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，對(duì)我國(guó)南方紫花苜蓿種植以及畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以鋁敏感型紫花苜蓿‘Wl440’為材料，通過(guò)水培方式研究磷對(duì)紫花苜蓿鋁毒的緩解效應(yīng)，初步探究磷緩解紫花苜蓿鋁毒的機(jī)理，以期為南方紫花苜蓿栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為鋁敏感型紫花苜蓿‘Wl440’，由北京正道有限公司提供。2018年1月將種子用蒸餾水沖洗干凈后均勻撒在浸透蒸餾水的濾紙上，并用保鮮膜封好，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚）、光強(qiáng)4000 lx，光照14 h 的人工氣候室中萌發(fā)培養(yǎng)。每天補(bǔ)充適量蒸餾水，確保種子浸潤(rùn)。6 d 后選取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，在莖基部用海綿包裹，固定在12 孔的泡沫板上，每孔固定6 株幼苗，置于1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液（pH=5.8）培養(yǎng)4 d，作為試驗(yàn)用苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置CK（空白對(duì)照）、P（磷）、Al 和Al+P 4 個(gè)處理，其中，對(duì)照（CK）：將幼苗置于簡(jiǎn)易［Ca（NO3）2］營(yíng)養(yǎng)液（pH=4.5）中培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液每2 d 更換一次。培養(yǎng)環(huán)境：溫度為25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光強(qiáng)為4000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)為14 h，相對(duì)濕度為60%；磷處理（P）：在對(duì)照處理的基礎(chǔ)上，每升營(yíng)養(yǎng)液中加入200 μmol·L-1KH2PO4，該磷濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得；鋁處理（Al）：在對(duì)照處理的基礎(chǔ)上，每升營(yíng)養(yǎng)液中加入100 μmol·L-1的AlCl3；鋁加磷處理（Al+P）：在鋁處理的基礎(chǔ)上，每升營(yíng)養(yǎng)液中加入200 μmol·L-1的KH2PO4。將各處理K+濃度補(bǔ)平至200 μmol·L-1，使各處理K+濃度相同，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至4.5。每個(gè)試驗(yàn)處理均設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)72 株苗。處理3、7 和10 d取樣，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

根長(zhǎng)測(cè)定：采用每3 株幼苗為一個(gè)重復(fù)，用直尺測(cè)量其根長(zhǎng)，計(jì)算平均值，作為一次重復(fù)。參照Dacosta 等［15］的方法測(cè)定葉片電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸（TBA）法［16］測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法［17］測(cè)定根系活力。采用乙醇：丙酮法［18］測(cè)定葉綠素含量。以上葉片均取頂部第1～2 個(gè)復(fù)葉。鋁含量測(cè)定：處理7 d 的幼苗取樣烘干后分別準(zhǔn)確稱(chēng)取葉片和根約0.1 g 左右，置于50 mL 離心管中，加入3 mL HNO3和1 mL H2O2，消煮2 h。靜置過(guò)夜后取上清液，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Optima 8000，鉑金埃爾默）測(cè)定鋁含量。各指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3 次。

光合氣體交換參數(shù)測(cè)定：用GFS-3000 光合熒光測(cè)定系統(tǒng)（WALZ，德國(guó)）測(cè)定光合氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）。將GFS-3000 光合儀預(yù)熱30 min 后設(shè)置測(cè)量參數(shù)，然后將Flow 設(shè)為750，Imp.為7。根據(jù)葉室面積，在Area 設(shè)置相應(yīng)的葉面積。相關(guān)參數(shù)設(shè)置完成后進(jìn)行ZP調(diào)0 和MP 調(diào)0，并開(kāi)始測(cè)定。葉室?jiàn)A上測(cè)定樣品葉片，觀察光合速率A 值穩(wěn)定后存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。每處理重復(fù)4 次。

用Imaging-PAM（WALZ，德國(guó)）測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSII）熒光參數(shù)，包括最大熒光（maximal fluorescence，F(xiàn)m），初始熒光（minimal fluorescence，F(xiàn)0），PSII 光合電子傳遞速率（the relative photosynthetic electron transport rate of photosystemⅡ，ETRII）。用Dual-PAM 100（WALZ，德國(guó)）測(cè)定光系統(tǒng)I（PSI）熒光參數(shù)，主要測(cè)定PSI 光合電子傳遞的相對(duì)速率（the relative photosynthetic electron transport rate of photosystemⅠ，ETRⅠ）。通過(guò)快速光曲線常用擬合方程P=PAR/（a·PAR2+b·PAR+c）［18］（其中，P 為快速光曲線；PAR 為光強(qiáng)）獲取擬合參數(shù)的公式為α=1/c，。其中α 為快速光曲線的初始斜率，反映了光合器官對(duì)光能的利用效率；rETRmax是擬合出來(lái)的潛在最大相對(duì)電子傳遞效率；Ik 是初始斜率線和rETRmax水平線的交點(diǎn)在坐標(biāo)橫軸上的投影點(diǎn)，代表了植物半飽和光強(qiáng)，反映植物耐受強(qiáng)光的能力［19-20］。每重復(fù)選擇3 個(gè)葉片，重復(fù)4 次。

有機(jī)酸測(cè)定：配制草酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用高效液相色譜做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用高效液相色譜測(cè)定鋁處理3、6、12、24 h 后根系有機(jī)酸分泌量和鋁處理3、7 和10 h 根系有機(jī)酸含量。根系有機(jī)酸的提取：根據(jù)Pellet 等［19］的方法略做修改。稱(chēng)取鮮樣0.5 g，放入離心管中，加入3 mL 超純水，75 ℃水浴提取15 min，在12000 r·min-1、4 ℃下離心30 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.25 μm）過(guò)濾，用C-18 Sep Pack 樣品過(guò)濾柱過(guò)濾除去酚類(lèi)物質(zhì)和固體顆粒，立即分析或放入冰箱（4 ℃）備用。根系分泌物收集：根據(jù)Mucha 等［20］的方法加以修改。將待測(cè)樣品根系用蒸餾水和超純水分別清洗5 次和3 次，最后將15 株幼苗的根系置于10 mL 超純水中，避光浸泡收集根分泌物6 h，然后立即用微孔濾膜過(guò)濾并冷凍干燥后，用5 mL 超純水溶解剩余殘?jiān)謩e用C-18 Sep Pack樣品過(guò)濾柱過(guò)濾和微孔濾膜過(guò)濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩ＩV條件：Hibar column RT 250 mm×4.6 mm C18柱，填料直徑5 μmol·L-1，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為1∶1 的0.025 mmol·L-1H2SO4和0.025 mmol·L-1KH2PO4緩沖液，使用前用微孔濾膜（0.25 μmol·L-1）過(guò)濾，流速為1 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL。每重復(fù)選擇3 個(gè)葉片，重復(fù)4 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 8.1 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較（P＜0.05）分析，使用SigmaPlot 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系的影響

鋁脅迫顯著抑制了紫花苜蓿根系生長(zhǎng)，而磷添加則緩解了鋁對(duì)紫花苜蓿根系生長(zhǎng)的抑制作用。與鋁處理相比，添加磷處理下的根長(zhǎng)分別增加21.95%（3 d）、36.03%（7 d）和44.33%（10 d）（圖1a）；鋁脅迫顯著降低了苜蓿根系活力，依次比對(duì)照降低22.10%（3 d）、23.31%（7 d）和31.99%（10 d），施加磷后的根系活力分別比鋁處理增加了12.83%（3 d）、16.55%（7 d）和18.06%（10 d）（圖1b）。

圖1 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系生長(zhǎng)和活力的影響Fig.1 Effects of phosphorus on root length and activity of alfalfa under aluminum stress

2.2 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量的影響

鋁脅迫顯著增加了苜蓿葉片電導(dǎo)率，依次比對(duì)照增加22.82%（3 d）、24.91%（7 d）和56.51%（10 d）。磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿葉片電導(dǎo)率含量有一定降低作用，比鋁處理分別降低11.55%（3 d）、9.79%（7 d）和9.99%（10 d）（圖2a）。

鋁脅迫明顯增加了苜蓿葉片的丙二醛（MDA）含量，依次比對(duì)照增加20.44%（3 d）、21.14%（7 d）和25.29%（10 d）。磷添加處理明顯緩解了鋁對(duì)葉片細(xì)胞膜的傷害，MDA 含量比鋁處理分別降低8.49%（3 d）、11.02%（7 d）和11.60%（10 d）（圖2b）。

圖2 磷對(duì)鋁脅迫下紫花苜蓿電導(dǎo)率和MDA 含量的影響Fig.2 Effects of phosphorus on the electrical conductivity and MDA content of alfalfa under aluminum stress

2.3 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素含量的影響

由表1可知，鋁脅迫處理7 和10 d，葉綠素a 的含量顯著低于對(duì)照，分別降低14.75%（7 d）和18.11%（10 d）。處理第10 天，施加磷顯著提高鋁脅迫苜蓿葉綠素a 的含量（17.31%）。鋁脅迫對(duì)葉綠素b 含量的影響較小，對(duì)照和施加磷處理之間的差異均不顯著。

表1 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素含量的影響Table 1 Effect of phosphorus on chlorophyll content of alfalfa under aluminum stress（μg·g-1 FW）

2.4 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿體內(nèi)鋁含量的影響

在CK 和P 處理中，紫花苜蓿根系中的Al 含量非常少，葉片中未檢測(cè)到Al 存在。磷添加明顯降低了苜蓿對(duì)鋁的吸收，根系和葉片中的鋁含量分別比鋁處理降低了81.53%和61.47%（圖3）。

圖3 磷對(duì)鋁脅迫下紫花苜蓿體內(nèi)鋁含量的影響Fig.3 Effect of phosphorus on aluminum content in root and leaves of alfalfa under aluminum stress

2.5 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿光合參數(shù)的影響

鋁脅迫顯著抑制了苜蓿葉片的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和光合速率，磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿葉片的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和光合速率產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用（表2）。與鋁處理相比，磷添加處理的蒸騰速率分別增加13.81%（3 d）、12.89%（7 d）和12.86%（10 d）；氣孔導(dǎo)度分別增加9.48%（3 d）、9.60%（7 d）和12.59%（10 d）；光合速率分別增加12.44%（3 d）、21.08%（7 d）和7.26%（10 d）。鋁脅迫顯著增加了苜蓿葉片的胞間CO2濃度，依次比對(duì)照增加11.44%（3 d）、23.42%（7 d）和25.84%（10 d），而磷添加一定程度減少了鋁脅迫苜蓿的胞間CO2濃度，依次比鋁處理減少9.24%（3 d）、7.90%（7 d）和9.53%（10 d）。

表2 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿光合參數(shù)的影響Table 2 Effects of phosphorus on photosynthetic parameters of alfalfa under aluminum stress

2.6 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿Fv/Fm的影響

鋁脅迫抑制了苜蓿最大光能轉(zhuǎn)化效率（圖4），熒光成像中，鋁脅迫下苜蓿葉片的熒光變淺，說(shuō)明鋁脅迫下苜蓿幼苗葉片最大光能轉(zhuǎn)化效率有所降低。磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿的最大光能轉(zhuǎn)化效率具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，熒光強(qiáng)度高于Al 處理。

圖4 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm的影響Fig.4 Effect of phosphorus Fv/Fm of alfalfa leaves under aluminum stress

2.7 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)I 快速光曲線的影響

鋁脅迫抑制了苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ和I 的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率，而添加磷明顯促進(jìn)了鋁脅迫苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率ETRII（圖5a）和光系統(tǒng)I 的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率ETRI（圖5b），在918 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)度下，CK、P、Al 和Al+P 處理的ETRII 值分別為14.9、14.5、8.1 和10.5 μmol·m-2·s-1；ETRI 值分別為101.9、93.8、63.9 和76.8 μmol·m-2·s-1，與Al 處理相比，P 添加對(duì)ETRII 和ETRI 的增幅分別達(dá)到29.6%和20.2%。

圖5 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿PSII 和PSI 快速光曲線的影響Fig.5 Effect of phosphorus on ETRII and ETRI of alfalfa under aluminum stress

與對(duì)照相比，鋁脅迫明顯抑制了苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ（PSII）的光能利用效率（α）和潛在最大相對(duì)電子傳遞效 率（rETRmax）（表3），而添加磷對(duì)鋁脅迫苜蓿rETRmax值有明顯的提升作用，同時(shí)增加了鋁脅迫苜蓿PSII 的半飽和光強(qiáng)（Ik），提高了鋁脅迫苜蓿PSII 對(duì)強(qiáng)光的耐受程度和最大相對(duì)電子傳遞效率。鋁脅迫明顯抑制了光系統(tǒng)I 的rETRmax和Ik，磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿光系統(tǒng)I 的Ik 有一定的修復(fù)作用。

表3 紫花苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ快速光曲線擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameter of fast light curve of photosystem Ⅱand I in Al-stressed alfalfa

2.8 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系有機(jī)酸分泌和體內(nèi)有機(jī)酸含量的影響

對(duì)根系草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和琥珀酸的分泌量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，鋁脅迫紫花苜蓿根系的草酸和檸檬酸分泌量在短時(shí)間（3 h）內(nèi)顯著增加，但未檢測(cè)出蘋(píng)果酸和琥珀酸（表4）。磷添加明顯降低了鋁脅迫苜蓿根系草酸和檸檬酸的分泌量，依次比鋁處理降低了27.27% 和16.00%（3 h）、27.20% 和13.14%（6 h）、20.47%和9.48%（12 h）、28.23%和12.59%（24 h）。

表4 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系有機(jī)酸分泌量的影響Table 4 Effect of P on organic acid secretion of alfalfa under aluminum stress（mg·mL-1）

鋁脅迫明顯降低了苜蓿根系的草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和琥珀酸含量，而磷添加明顯提高了鋁脅迫苜蓿根系的草酸和蘋(píng)果酸含量（表5）。磷添加處理的根系草酸和蘋(píng)果酸含量分別比鋁處理增加了19.63%和42.72%（3 d）、7.29%和5.13%（7 d）、22.73%和284.00%（10 d）。磷對(duì)鋁脅迫苜蓿根系琥珀酸和檸檬酸含量的促進(jìn)作用不顯著。

表5 磷對(duì)鋁脅迫下紫花苜蓿根系有機(jī)酸含量的影響Table 5 Effect of P on organic acid content in alfalfa under aluminum stress（mg·mL-1）

3 討論

鋁毒是抑制酸性土壤植物生長(zhǎng)的主要因素，鋁敏感植物對(duì)鋁脅迫的最初響應(yīng)是根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)和水分的吸收利用。磷是植物生長(zhǎng)必需的大量元素，添加200 μmol·L-1磷可明顯促進(jìn)鋁脅迫紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)和根系活力，表明磷具有緩解苜蓿鋁毒害的功能。非生物脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)受到傷害，質(zhì)膜透性增大，電解質(zhì)外滲致使電導(dǎo)率升高［21］。本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致葉片電導(dǎo)率顯著上升，苜蓿細(xì)胞受到鋁毒傷害，而添加磷后葉片的相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于鋁處理，表明磷可以有效緩解鋁脅迫對(duì)苜蓿葉片質(zhì)膜造成的傷害，這與王保明等［22］的研究結(jié)果一致。MDA 是積累膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映植物細(xì)胞膜的損傷程度，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)過(guò)多MDA 積累會(huì)進(jìn)一步毒害生物體［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫使得苜蓿葉片MDA 含量增加，而添加磷后，MDA 含量顯著下降，說(shuō)明磷能夠減輕鋁毒造成的細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，保護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。在油茶、玉米（Zea mays）、水稻等植物的研究中也發(fā)現(xiàn)，磷對(duì)鋁脅迫造成的植物生理傷害有明顯的緩解作用［25］。

葉綠素是植物光合作用的重要物質(zhì)，承擔(dān)光能的捕獲、吸收和分配功能，影響植物的光合作用。本研究中，鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素a 和葉綠素b 的含量下降，原因之一是Al3+與Mg2+競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)膜的結(jié)合位點(diǎn)，影響植物對(duì)Mg2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制了葉綠素的合成［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素a 比葉綠素b 對(duì)鋁更加敏感，這與肖祥希等［27］的研究結(jié)果一致。添加磷后，鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素a 和葉綠素b 含量明顯提升，表明磷能夠緩解鋁脅迫對(duì)葉綠素a的傷害。氣孔和非氣孔限制都會(huì)影響植物的光合速率，氣孔限制是由氣孔導(dǎo)度下降導(dǎo)致的胞間CO2濃度降低，使暗反應(yīng)速率下降［28］；非氣孔限制主要由于凈光合速率下降所引起的胞間CO2積累，葉肉細(xì)胞對(duì)CO2的固定能力減弱，最終引起光合速率下降。本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致紫花苜蓿蒸騰速率和光合速率下降，原因是鋁脅迫引起紫花苜蓿氣孔導(dǎo)度下降，從而降低了葉片的蒸騰作用；而胞間CO2濃度上升說(shuō)明光合速率的降低并非氣孔導(dǎo)度下降導(dǎo)致CO2不足所引起，而是由于植物光合系統(tǒng)破壞，導(dǎo)致對(duì)CO2的同化能力下降所引起。添加磷后，鋁脅迫苜蓿葉片的胞間CO2濃度下降，光合速率顯著增加，表明磷降低了鋁對(duì)苜蓿葉肉細(xì)胞的傷害，增加了葉肉細(xì)胞對(duì)CO2的溶解能力，從而提高了光合速率。此外，磷添加對(duì)鋁毒導(dǎo)致的PSII 活性下降具有明顯的修復(fù)作用，提高了鋁脅迫苜蓿PSII 對(duì)強(qiáng)光的耐受程度和最大相對(duì)電子傳遞效率，從而促進(jìn)了鋁脅迫苜蓿的光化學(xué)效率、ETRII 和ETRI 的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率。ETRI 的升高能夠有效降低鋁毒引起苜蓿葉肉細(xì)胞類(lèi)囊體的電子積累數(shù)量，以及由此引起的類(lèi)囊體活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加，從而保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)，提高光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的效率。

鋁脅迫下，許多植物根系分泌有機(jī)酸，并與鋁形成螯合物以減輕鋁毒，同時(shí)能夠加速土壤中磷的溶解，增加磷的有效性，鋁誘導(dǎo)苜蓿分泌的有機(jī)酸主要包括草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸等，其中草酸活化土壤磷的功能最強(qiáng)，其次是檸檬酸、蘋(píng)果酸。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下紫花苜蓿根系草酸和檸檬酸的分泌量明顯增加，而且響應(yīng)十分迅速，在3～6 h，說(shuō)明促進(jìn)有機(jī)酸分泌是紫花苜蓿適應(yīng)鋁脅迫的重要機(jī)制，一方面，螯合根際周?chē)钚凿X，降低鋁的活性和根系對(duì)鋁的吸收，另一方面，活化根際磷，促進(jìn)根系對(duì)磷的吸收，平衡體內(nèi)磷的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。許多研究表明鋁脅迫能夠誘導(dǎo)植物有機(jī)酸合成酶的活性和基因表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)根系大量分泌檸檬酸［29］。但也有研究表明植物分泌有機(jī)酸與有機(jī)酸合成酶活性無(wú)關(guān)，Yu 等［30］研究表明，鋁處理下豇豆（Vigna unguiculata）CS、蘋(píng)果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性均未增加，但豇豆根系仍分泌大量有機(jī)酸，抵抗鋁毒害。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下紫花苜蓿在分泌草酸和檸檬酸的同時(shí)，根系的有機(jī)酸含量有所減少，表明鋁脅迫下苜蓿根系有機(jī)酸的合成并未增加。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在磷的作用下，鋁脅迫紫花苜蓿有機(jī)酸的分泌量明顯減少，但根系草酸和蘋(píng)果酸含量明顯增加，說(shuō)明磷促進(jìn)苜蓿耐鋁毒能力與草酸和蘋(píng)果酸合成有關(guān)，而不是通過(guò)誘導(dǎo)植物分泌有機(jī)酸來(lái)緩解鋁毒。一方面，草酸和檸檬酸可以在細(xì)胞內(nèi)與鋁形成對(duì)植物細(xì)胞無(wú)害的絡(luò)合物，從而阻止鋁與細(xì)胞成分結(jié)合，降低鋁毒害。另一方面檸檬酸、蘋(píng)果酸參與三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)，從而影響植物呼吸作用和光合作用。鋁脅迫下由于有機(jī)酸（檸檬酸、蘋(píng)果酸）含量顯著降低影響苜蓿光合代謝，而施加磷后檸檬酸、蘋(píng)果酸含量增加，光合系統(tǒng)的損傷程度降低，從而緩解了鋁毒對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響。

4 結(jié)論

磷處理明顯緩解了鋁對(duì)紫花苜蓿幼苗的毒害作用，光合能力、光化學(xué)效率和電子傳遞速率明顯增強(qiáng)，生長(zhǎng)速率明顯增加。添加磷引起鋁脅迫苜蓿根系草酸和蘋(píng)果酸含量增加是磷緩解苜蓿鋁毒害的主要原因之一。本研究結(jié)果揭示了磷和鋁共同作用下，紫花苜蓿生長(zhǎng)和光合生理之間的相關(guān)關(guān)系，磷通過(guò)提高根系有機(jī)酸含量，特別是草酸、檸檬酸含量改善鋁脅迫苜蓿光合生理，從而緩解苜蓿鋁毒害，為進(jìn)一步研究紫花苜蓿抗鋁毒的生理和分子機(jī)理提供了依據(jù)。