細胞損傷微環(huán)境多核巨細胞的形成與分裂觀察

王 佳 葉冬梅 袁小林

大連大學附屬中山醫(yī)院中心實驗室，遼寧大連 116001

多核巨細胞（multinucleated giant cells，MGC）是與肉芽腫相關(guān)的同型巨噬細胞合胞體[1]，其種類繁多，如破骨細胞、朗漢斯巨細胞、異物巨細胞等。其中破骨細胞的研究最多，為MGC 融合機制提供了更深入研究[2-3]。MGC 的形成始于單核前體細胞，通過促融合細胞因子獲得融合能力，擴展富含肌動蛋白的絲狀投射，細胞相互遷移，并通過絲狀突起或融合足發(fā)生黏附。在相應位置，融合劑使質(zhì)膜靠近，去除中間膜實現(xiàn)細胞質(zhì)共享形成MGC，但其作用及生理功能尚不清楚[4]。本課題組在研究中觀察到巨噬細胞與其他細胞系體外共培養(yǎng)，當細胞受到損傷或發(fā)生壞死時或有巨大細胞及典型MGC 出現(xiàn)。本研究對細胞損傷微環(huán)境中MGC 的形成進行動態(tài)觀察，為MGC 的形成機制及其功能的研究提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠RAW 264.7 巨噬細胞購自中科院；HL-1 小鼠心房肌細胞購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基（天津灝洋華科生物科技有限公司，HY1640）；DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基（沃卡威生物技術(shù)有限公司，SH30022.01）；優(yōu)級胎牛血清（天津灝洋華科生物科技有限公司，11011-8611）；青鏈霉素混合液（Hyclone，S110JV）；0.25%乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶（Hyclone，KGY0012）；Type 120c 普通光學顯微鏡（尼康儀器有限公司）；Nikon-ECLIPSE-Ti 活細胞工作站（上海衡浩儀器有限公司）；DiO 熒光染料（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，D-9102）；Hoechst 33342 熒光染料（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，D-9105）；Hitachi 掃描電鏡（相確精密儀器有限公司）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，C2055）。

1.3 巨噬細胞和心肌細胞共培養(yǎng)方法

巨噬細胞和心肌細胞分別單獨培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中細胞密度達到80%以上，分別用0.25% EDTA 胰蛋白酶進行消化，離心力179×g，離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)基清洗兩次，備用。收集巨噬細胞和心肌細胞，按照1∶3 比例混合，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml 接種于普通培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)，分別于停止換液的第9～15 天拍照，觀察MGC 形成現(xiàn)象。對照采用單獨培養(yǎng)心肌細胞至第9 天進行拍照。

1.4 MGC 形成的動態(tài)觀察

共培養(yǎng)方法同上，接種于普通和共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，前者設置實驗組（不換液不傳代）和對照組（定期換液），37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)，使用普通光學顯微鏡于第0～15 天拍照，計數(shù)第6、9、12 天實驗組多核巨細胞的數(shù)量；同條件再設置實驗組和對照組，放到活細胞工作站中，動態(tài)觀察MGC 形成及分裂的全過程。

1.5 MGC 形成過程中巨噬細胞與心肌細胞的相互作用

收集巨噬細胞和心肌細胞，用培養(yǎng)基重懸，分別加入DiO 熒光染料（1 mmol/ml）、Hoechst33342 熒光染料（1 μg/ml）混勻。37℃避光孵育20 min，離心力179×g，離心5 min，去上清，重復洗滌2 次，按照1∶3比例共培養(yǎng)，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml 接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，不換液不傳代，置于活細胞工作站中，綠、藍二色熒光通道定時攝片，動態(tài)觀察MGC 形成。

1.6 掃描電鏡觀察MGC 形成

將巨噬細胞和心肌細胞按照1∶3 比例接種到內(nèi)置玻片的培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2條件下等待細胞爬片，待出現(xiàn)MGC 后，取出培養(yǎng)皿，用1×PBS 漂洗3 次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，再進行乙醇梯度脫水，通風干燥。使用掃描電鏡觀察，拍攝MGC 及其超微結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞損傷微環(huán)境MGC 形成現(xiàn)象

細胞停止換液傳代，會出現(xiàn)一些體積巨大的細胞，而且細胞的數(shù)量隨著停止換液時間的延長而增多。停止換液初期與后期出現(xiàn)巨大細胞的形態(tài)有明顯差異，初期形態(tài)規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，而后期形態(tài)不規(guī)則、偽足多。這些巨細胞在共培養(yǎng)體系中出現(xiàn)，而單純培養(yǎng)的正常心肌細胞不出現(xiàn)。見圖1。

圖1 心肌細胞、巨噬細胞和心肌細胞共培養(yǎng)（100×）

2.2 細胞損傷微環(huán)境與MGC 形成的動態(tài)觀察

根據(jù)每天觀察MGC 是否形成，設置如下圖2 時間點，觀察MGC 形成動態(tài)過程。結(jié)果顯示，在光學顯微鏡下觀察到MGC 形成動態(tài)過程。第6 天，實驗組的心肌細胞開始出現(xiàn)損傷和壞死，巨噬細胞吞噬或融合受損心肌細胞形成巨大細胞，巨大細胞多為多個細胞形成的合胞體，合胞體內(nèi)的多個細胞核大小均一、形態(tài)規(guī)則。第12 天出現(xiàn)的巨細胞，形態(tài)不規(guī)則呈多形性，有多偽足，吞噬能力較強。MGC 數(shù)量隨損傷因素作用的時間延長而增加（P ＜0.05）。對照組定期換液，使得心肌細胞沒有受損，沒有MGC 形成。見圖2～3。

圖2 光學顯微鏡觀察多核巨細胞形成的動態(tài)過程（200×）

圖3 實驗組多核巨細胞數(shù)量與損傷因素作用時間的關(guān)系

活細胞工作站觀察到MGC 形成分裂的全過程。第6～9 天巨噬細胞與受損心肌細胞開始融合形成MGC，內(nèi)含多個核的合胞體，其形成的合胞體可進一步分裂增殖，并且分裂的子細胞具有較強的運動功能，見圖4。

圖4 活細胞工作站觀察多核巨細胞形成分裂全過程（200×）

2.3 染色（未染色）細胞融合形成MGC

為進一步證實巨細胞類型，采用活細胞工作站和掃描電鏡，結(jié)果顯示染色細胞融合形成MGC，第6～9 天開始出現(xiàn)巨大細胞多為巨噬細胞與受損心肌細胞融合而成，而后期出現(xiàn)的巨細胞為巨噬細胞吞噬破碎的心肌細胞。見圖5（封三）。未染色細胞融合形成MGC，多個細胞膜融合，內(nèi)含多個核，見圖6。

圖5 活細胞工作站觀察染色細胞融合形成多核巨細胞（200×）

圖6 掃描電鏡觀察未染色細胞融合形成多核巨細胞（2500×）

3 討論

停止換液后，細胞培養(yǎng)微環(huán)境中糖、營養(yǎng)成分耗竭，代謝產(chǎn)物增多，使心肌細胞發(fā)生損傷甚至壞死；而巨噬細胞能量代謝有特殊性，對酸性環(huán)境及糖、營養(yǎng)缺乏有較強的耐受能力，以糖的無氧酵解為主要能量，所以停止換液后共培養(yǎng)中的巨噬細胞不會受到損傷[5-8]。壞死細胞可被巨噬細胞吞噬，部分受損傷的細胞可與巨噬細胞融合形成MGC。本研究結(jié)果顯示，巨噬細胞與心肌細胞共培養(yǎng)停止換液6 d 后開始出現(xiàn)MGC[9]，且MGC 的數(shù)量隨停止換液時間的延長而增多，當大量死亡破碎心肌細胞出現(xiàn)后，巨噬細胞吞噬壞死心肌細胞形成吞噬型巨大細胞。而常規(guī)換液傳代的共培養(yǎng)體系內(nèi)無MGC 及吞噬型巨大細胞出現(xiàn)，提示細胞損傷后可導致MGC 形成。MGC 為巨噬細胞與巨噬細胞或與其他類型細胞融合而成，MGC 在體內(nèi)多見，如破骨細胞、腫瘤組織、結(jié)核、皮膚，MGC 形成的機制及其生理功能尚不十分清楚[10]。從本研究結(jié)果看，當心肌細胞受到損傷的初期易于與巨噬細胞融合形成合胞體，合胞體分裂的子細胞會有巨噬細胞線粒體及其他成分，使損傷的組織細胞得到一定程度的修復[11]。

心肌梗死發(fā)病率與死亡率較高，盡管支架技術(shù)能夠恢復血供，但壞死組織纖維化，影響心肌功能，并為進一步發(fā)展留下隱患[12-13]。急性期后壞死組織若能被修復或再生將能夠恢復組織器官功能，對于降低死亡率及延長生存期具有重要意義[14]。巨噬細胞分布于全身組織，其主要來源：一是血液中單核細胞進入組織并分化為巨噬細胞[15]；二是來源于卵黃囊，細胞示蹤實驗結(jié)果證實卵黃囊中的巨噬細胞在胚胎發(fā)育的早期就遷移并停留在組織中，成為組織駐留巨噬細胞[16]。其在器官形成、發(fā)育及損傷組織的修復再生中起關(guān)鍵作用[17]，而巨噬細胞與受損心肌細胞融合形成合胞體并分裂出具有雙重特性的雜交細胞很可能是巨噬細胞促進損傷組織修復再生的機制之一。細胞損傷多由病理原因?qū)е拢奘杉毎烧T發(fā)一系列反應，促進損傷組織修復再生以恢復功能[18-21]。而且細胞損傷微環(huán)境中巨噬細胞的數(shù)量、活化與極化狀態(tài)直接影響修復方式和程度[18]。在腫瘤壞死區(qū)域大量巨噬細胞浸潤，出現(xiàn)大量吞噬壞死細胞的巨噬細胞（可遞呈腫瘤抗原誘發(fā)抗腫瘤特異免疫反應）和少量MGC[22]，而腫瘤細胞與巨噬細胞融合的合胞體分裂后形成的雜交細胞比非融合癌細胞生成的腫瘤生長速度更快[23-24]。MGC 的存活期長，同時MGC 及其分裂后的雜交細胞對不良微環(huán)境耐受性極強，具有抗化療藥物、射線的能力[25-26]。

本研究結(jié)果提示，細胞損傷微環(huán)境中巨噬細胞可與受損心肌細胞融合形成MGC，而且合胞體可進一步分裂增殖，其融合作用可能有助于心肌梗死損傷組織修復再生，為研究治療心肌梗死的方法提供科學依據(jù)。為進一步研究損傷微環(huán)境中異體MGC 形成的機制及其雜交子細胞生物學特性具有重要意義。