結(jié)直腸癌組織高頻突變基因與臨床病理特征及MMR 基因突變的相關(guān)性分析

曹躍鵬，劉東方，陶勇，武鴻彪，吳愛華

近年來，結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢，成為我國最常見的、發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。盡管手術(shù)方式和輔助治療手段不斷發(fā)展，但是其總體療效仍不盡人意，約50%的患者術(shù)后因局部復發(fā)或轉(zhuǎn)移而最終死亡[2]。CRC 的發(fā)病機制尚未完全明確，有多個基因及其相關(guān)的腫瘤信號通路分別或同時調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，目前研究較多的通路機制包括錯配修復（MMR）蛋白功能缺失、基因突變（BRAF、KRAS、p53、PIK3CA 等）和CpG 島甲基化表型（CIMP）等[3-5]。隨著分子檢測技術(shù)尤其是二代測序（NGS）極大的拓展了對結(jié)直腸癌特征基因的認識，臨床研究表明針對特定靶點的分子靶向藥物可以改善患者預后并提高其生存周期，為發(fā)展新的靶向藥物和個體化免疫治療奠定了基礎(chǔ)[5-6]。筆者通過分析128 例CRC 患者基因突變位點和新發(fā)位點突變情況，探討高頻突變基因與臨床病理特征及MMR 基因突變的相關(guān)性，旨在為臨床CRC患者個體化治療提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月至2020 年12 月在寧波市第一醫(yī)院收治的經(jīng)病理學證實的CRC患者的臨床資料，最終納入臨床資料完整、腫瘤組織標本采用NGS 檢測18 項基因位點突變的128 例患者。128 例CRC 患者中男81例，女47 例；年齡31 ～85 歲，平均（63.6±9.9）歲。腫瘤位于右半結(jié)腸者30例，位于左半結(jié)腸者35 例，位于直腸者63 例。腫瘤直徑≥5 mm 者為53 例，＜5 mm 者為75 例。TNM 分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期9 例，Ⅲ期53 例，Ⅳ期62 例。發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69 例，發(fā)生脈管浸潤者65 例。本研究已獲得寧波市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 二代測序檢測及突變分析 用于檢測的組織為石蠟包埋（FFPE）或新鮮組織。FFPE 樣本組織塊先切片再提取DNA，新鮮組織樣本直接提取DNA。DNA 提取采用QIAamp DNA FFPE 試劑盒，依據(jù)試劑盒操作手冊進行DNA提取。DNA 定量采用Qubit dsDNA HS Assay 測定各標本DNA 濃度。高通量檢測基于Illumina Next-seq 500 檢測平臺，體細胞突變平均測序深度不小于1 000X，突變比例的檢測下限為5%。檢測的變異類型包括單核苷酸變異（SNV）、小片段插入/缺失（InDel），拷貝數(shù)變異（CNV）、基因融合（Gene Fusion），但不包括染色體數(shù)目異常以及特殊類型的突變。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用2檢驗或Fisher’s 精確概率法分析基因突變狀態(tài)與臨床病理特征及MMR基因突變的關(guān)系。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基因突變NGS 檢測結(jié)果分析 本研究選擇的18 個CRC相關(guān)基因包括KRAS、NARS、BRAF、PIK3CA、APC、TP53、FBXW7、PTEN、ERBB2、EGFR、HRAS、MET、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、AKT1 和NTRK1。6 例（4.7%）患者檢測的基因均未發(fā)生突變，其余122 例（95.3%）患者檢測到至少1個基因發(fā)生突變。本研究共檢測出341次突變，APC 基因的突變率為77.3%（99/128），TP53 基因的突變率為73.4%（94/128），KRAS基因的突變率為42.2%（54/128），F(xiàn)BXW7 基因的突變率為16.4%（21/128），PIK3CA 基因的突變率為15.6%（20/128），其他12 個基因的突變率均低于10%；此外，HRAS基因未檢測到有意義的突變位點（圖1）。

圖1 患者基因突變NGS 檢測結(jié)果分布

2.2 分析熱點突變和新發(fā)突變的分布 本研究共檢測出17 個基因的224 種突變，其中包括191 種熱點突變（體細胞突變癌癥目錄（COSMI）數(shù)據(jù)庫已收錄）和33 種新發(fā)突變（COSMIC數(shù)據(jù)庫未收錄）（圖2）。這33 種新發(fā)突變位點對應的基因共14 個，包括APC、TP53、FBXW7、PIK3CA、KRAS、PTEN、EGFR、ERBB2、MET、NRAS、PMS2、NTRK1、MSLH1 和AKT1。其中TP53基因的新發(fā)突變有6種，其次為ERBB2、MET 和PMS2 各4 種（表1）。錯義突變?yōu)樽畛Ｒ姷耐蛔冾愋停?4/33），其次分別為移碼突變（4/33）、整碼缺失突變（3/33）、整碼插入突變（1/33）、剪接區(qū)域突變和內(nèi)含子突變（1/33）。

表1 高頻突變基因新發(fā)突變位點及功能預測

圖2 熱點突變和新發(fā)突變的分布

2.3 基因新發(fā)突變的致病性分析 筆者采用PhyloPhen2 及SIFT（sorts intolerant from tolerant）軟件來探究新發(fā)突變的致病性。SIFT 軟件預測結(jié)果顯示，在24 個錯義突變位點中，有13 個位點顯示有害的，11 個位點顯示可容忍。PolyPhen2 軟件預測結(jié)果顯示，在24 個位點中，有9 個位點顯示很可能有害，有4 個位點顯示可能有害，有11 個位點顯示良性。綜合這兩個軟件的分析結(jié)果，有7 個位點預測結(jié)果都顯示良性或者影響較小，有8 個位點預測結(jié)果都顯示有影響或有害，有9 個位點至少在某一個軟件的預測結(jié)果顯示有影響或者有害。

2.4 高頻突變基因與臨床病理特征的關(guān)系 TP53 基因突變率與脈管浸潤有關(guān)（P ＜0.05）。APC 基因突變在左半結(jié)腸癌的患者中突變率較高（P ＜0.05）。KRAS基因突變率與腫瘤原發(fā)部位有關(guān)（P ＜0.05）。PIK3CA 基因在女性、腫瘤直徑≥5 mm 及未發(fā)生脈管浸潤的患者中具有較高的突變率（均P ＜0.05）。FBXW7 基因在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中突變率較高（P ＜0.05）。見表2。

表2 高頻突變基因與臨床病理特征及MMR 基因突變的相關(guān)性分析

2.5 高頻突變基因與MMR 基因突變的相關(guān)性分析 錯配修復基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）均未發(fā)生突變被歸類為MMR 未突變，至少一個錯配修復基因發(fā)生突變被歸類為MMR 突變。在128 例CRC 患者中，MMR 基因的突變率為7.8%（10/128），其中PMS2 的突變率為3.9%（5/128），MSH2 的突變率為2.3%（3/128），MLH1 和MSH6 的突變率均為0.78%（1/128），發(fā)生突變的類型均為錯義突變。TP53、APC、KRAS、PIK3CA、FBXW7 基因突變率與MMR基因的突變率沒有相關(guān)性（P ＞0.05）。

3 討論

CRC 是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)文獻報道，我國CRC 的總體發(fā)病率躍居惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，死亡率位居第五位，均較過去明顯升高[7]。大量研究表明CRC 的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多步驟、多途徑的過程，與多個癌基因的激活或抑癌基因的失活有關(guān)[2]。近年來，表皮生長因子受體（EGFR）單抗在晚期CRC 的治療中取得了較好的療效[8]。KRAS、NRAS、PIK3CA 和BRAF基因是EGFR 依賴的下游信號轉(zhuǎn)導通路中的重要基因，也是目前CRC 最常見的治療靶點基因[9]。當RAS 家族或BRAF 或PIK3CA 等基因發(fā)生突變時，易導致EGFR單抗治療無效；因此，評估基因突變狀態(tài)有助于觀察結(jié)直腸癌的治療效果[10]。由于一代測序檢測的基因有限，以及EGFR通路存在多個下游基因，是否有其他基因?qū)χ委熜Чa(chǎn)生影響尚不清楚。曾有文獻報道SMAD4 和FBXW7 等基因突變、ERBB2 基因擴增、MMR或微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）等亦對CRC的預后判斷及治療有影響[6,11]。隨著NGS 在臨床上的廣泛應用，對于CRC 的基因及位點的突變的了解為臨床CRC 的靶向藥物的精準化治療提供了可靠的理論基礎(chǔ)。

本研究中，納入了128 例CRC 組織樣本共檢測了CRC相關(guān)熱點基因18個，KRAS 基因是突變率（42.2%）最高的致癌基因，APC基因是突變率（77.3%）最高的抑癌基因，和報道數(shù)據(jù)基本相符[12]。本研究統(tǒng)計了33 種新發(fā)突變的具體情況，新發(fā)突變率最高的基因為TP53。通過生物信息學軟件分析新發(fā)突變的致病性，至少17位點存在重大影響或者有害，這些新發(fā)突變基因的突變、缺失或擴增，反應了每種突變狀態(tài)與腫瘤存在可能的致病風險，很有可能是導致CRC 發(fā)生的原因，也為后續(xù)研究CRC 致病機制以及探究新的治療靶點提供理論依據(jù)。

APC和TP53 是CRC中最常見的突變基因，也是重要的抑癌基因[13]。本研究發(fā)現(xiàn)TP53 基因突變率與腫瘤脈管浸潤相關(guān)，這與文獻[14] 報道結(jié)果一致。KRAS 和PIK3CA 是CRC 中常見的原癌基因。有研究表明單純PIK3CA 突變與患者的生存期無明顯相關(guān)性，約70%轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌PIK3CA 基因突變常合并KRAS 突變或其他突變，而KRAS 基因突變與患者性別、組織學類型，原發(fā)部位、分化程度等臨床病理特征有關(guān)[15]。本研究中20 例PIK3CA 的突變患者中，合并KRAS基因突變者13 例，因此多基因的聯(lián)合檢測對臨床治療方案至關(guān)重要。

綜上所述，本研究共完成了對128例CRC 組織的18 個基因的高通量測序分析，重點關(guān)注了高頻突變基因的突變分布及與臨床病理特征的相關(guān)性，為篩選最適宜靶向治療的患者個體化用藥提供了新的檢測思路及途徑。本研究對CRC 的臨床診治具有一定的指導意義，但仍需進一步大樣本數(shù)據(jù)的驗證。