分子標(biāo)記物BLM 聯(lián)合超聲在乳腺癌診斷中的價(jià)值研究

劉秀祥，陳毅作

全球乳腺癌病例占惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的11.6%，而乳腺癌的死亡率占惡性腫瘤死亡病例數(shù)的6.6%[1]。乳腺癌早期癥狀不典型，因此提高乳腺癌的檢出率顯得尤為重要[2]。Bloom 解旋酶（BLM）是一種乳腺癌易感基因，參與DNA解螺旋及DNA損傷修復(fù)等過程，在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，與乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤耐藥等過程密切相關(guān)[3]。與CT 診斷和MRI診斷相比，超聲具有敏感性高、操作簡便、無輻射和動(dòng)態(tài)觀察腫瘤病灶等優(yōu)點(diǎn)[4]。隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，超聲能夠有效反映腫瘤血流動(dòng)力學(xué)及腫瘤形態(tài)，但是在診斷敏感性和成像分辨率上仍然存在一定局限性，將超聲成像技術(shù)聯(lián)合生化指標(biāo)應(yīng)用于乳腺癌診斷逐漸得到廣泛關(guān)注。本研究探討血清BLM 聯(lián)合超聲在乳腺癌診斷中的價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年3 月至2021 年3 月浙江省溫州市人民醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院共同收治的40 例乳腺癌患者作為觀察組。年齡38～65 歲，平均（50.8±11.3）歲；平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（20.56±2.11）kg/m2。腫瘤類型：原位癌18例，浸潤性導(dǎo)管癌14例，浸潤性小葉癌5 例和腺癌3 例。選擇同期診治的40 例乳腺良性腫瘤患者作為對照組，年齡40 ～65 歲，平均（51.1±12.7）歲；平均BMI（21.09±2.13）kg/m2。腫瘤類型：纖維腺瘤17 例，乳腺大導(dǎo)管乳頭狀瘤8 例，乳腺囊性增生瘤10 例，乳腺囊性脂肪瘤5 例。兩組上述資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。患者或家屬均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)診斷為乳腺癌；（2）入院前無放化療治療史；（3）非乳腺癌復(fù)發(fā)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他類型腫瘤；（2）入院前3 個(gè)月內(nèi)有外科手術(shù)史。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器 引物和質(zhì)粒均購自蘇州金唯智生物科技有限公司，mirVanaTMmiRNA 提取試劑盒（貨號：AM1560）和高容量RNA-to-cDNA試劑盒（貨號：4387406）購自美國賽默飛世爾科技有限公司，SYBR Green RNA熒光定量PCR 試劑盒（貨號：WH0125）購自北京百奧萊博科技有限公司，EDTA-2K管（貨號：R10128）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，化學(xué)發(fā)光分析儀（型號：C411）購自瑞士羅氏cobas 科技有限公司，超聲診斷儀（型號：LOGIQ E9）購自美國GE 科技有限公司。

1.2.2 血清BLM 蛋白和BLM-mRNA水平檢測 患者入院后使用EDTA-2K管采集2 ml全血，于室溫靜置30 min后3 500 r/min 離心10 min。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清BLM蛋白水平，使用化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑盒進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。BLM 蛋白正常值1 ～4 ng/ml。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測血清BLMmRNA 水平。使用mirVanaTMmiRNA 提取試劑盒提取總RNA，采用高容量RNA-to-cDNA 試劑盒對mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系：2×RT buffermix10 l，20×RT Enzyme mix 1 l，RNA 9 l。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃60 min，95 ℃5 min。采用SYBR Green RNA 熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，熒光定量反應(yīng)體系為SYBR mix 10 l，正向引物0.2 l，反向引物0.2 l，DNA 模板2.6 l，雙蒸水7 l，總體系20 l。PCR 擴(kuò)增采用兩步法擴(kuò)增，程序如下：95℃20min，95℃15s，60℃35s，35 個(gè)循環(huán)。BLM 正向引物：5’- GCAGCGACAGT-GCGAGCT-3’，BLM 反向引物：5’- TCCGAGTGAGTTAGGAAG-3’。內(nèi)參基因選擇16SrRNA 基因，正向引物：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGC ACATATAC-3’，反向引物：5’-CCTGGCGTCGTGCTTAGTGAT-3’。根據(jù)2－△△Ct法計(jì)算BLM 的相對表達(dá)量。

1.2.3 乳腺超聲檢測 采用GE LOGIQ E9 超聲診斷儀，ML6-15 線陣探頭。乳腺造影設(shè)置，脈沖反相諧波成像技術(shù)，機(jī)械指數(shù)調(diào)節(jié)至0.07，造影總增益設(shè)置為70%，深度2.5 cm，單點(diǎn)聚焦置于圖像最深部。對比劑為SonoVue。常規(guī)超聲顯示腫瘤，選取最大切面，調(diào)節(jié)圖像至最佳，切換入超聲造影模式，保持最大切面不變，連續(xù)實(shí)時(shí)觀察病灶動(dòng)態(tài)灌注過程3 min。BI-RADS 分級：0 級，超聲結(jié)果未顯異常，需結(jié)合其他類型檢查結(jié)果進(jìn)行綜合評估；1 級，未有異常變化，基本判定為正常；2 級，基本能夠排除惡性腫瘤，為良性征象；3 級，良性病變征象；4級，可疑惡性，需進(jìn)一步穿刺進(jìn)行病理學(xué)檢查；5 級，可疑惡性；6 級，已經(jīng)病理學(xué)診斷確診為惡性腫瘤[5]。

1.3 觀察指標(biāo) 兩組血清BLM蛋白和BLM-mRNA 水平，超聲、血清BLM 蛋白單獨(dú)及聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)，其中特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%，敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，陽性預(yù)測值=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%，陰性預(yù)測值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%，約登系數(shù)=敏感度+特異度―1[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t 檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法分析；診斷價(jià)值分析采用受試者工作特征曲線（ROC）。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清BLM 蛋白和BLMmRNA 水平比較 觀察組血清BLM 蛋白和BLM-mRNA 水平均高于對照組（均P ＜0.05），見表1。

表1 兩組血清BLM 蛋白和BLM-mRNA水平比較

2.2 BI-RADS 分級與血清BLM 蛋白的相關(guān)性分析BI-RADS分級與血清BLM蛋白水平呈正相關(guān)性（r=0.9081，P ＜0.05）。

2.3 超聲、BLM蛋白單獨(dú)及聯(lián)合診斷乳腺癌與病理診斷結(jié)果比較 超聲、BLM蛋白聯(lián)合診斷乳腺癌的診斷符合率為92.50%，高于超聲、BLM 蛋白單獨(dú)檢測的72.50%和65.00%（=12.331、15.732，均P ＜0.05）。見表2。

表2 超聲、BLM 蛋白單獨(dú)及聯(lián)合診斷乳腺癌與病理診斷結(jié)果比較 例

2.4 超聲、BLM蛋白單獨(dú)及聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)比較 超聲和BLM蛋白聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)均高于超聲和BLM蛋白單獨(dú)檢測（均P ＜0.05），見表3。

表3 超聲、BLM 蛋白單獨(dú)及聯(lián)合診斷乳腺癌的特異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值和約登系數(shù)比較

2.5 超聲、BLM 蛋白單獨(dú)及聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷價(jià)值分析 超聲和BLM 蛋白單獨(dú)及聯(lián)合判斷乳腺癌的AUC值分別為0.814、0.830 和0.913，漸進(jìn)95% CI 分別為0.749 ～0.879、0.768～0.891、0.868 ～0.958。見圖1。

圖1 超聲、BLM 蛋白單獨(dú)及聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷價(jià)值分析

3 討論

乳腺癌是目前排名第一的女性惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年增長趨勢[7]。提高乳腺癌的早期檢出率是目前乳腺癌臨床診斷和治療的工作重點(diǎn)之一。有研究報(bào)道在乳腺癌患者中腫瘤血清標(biāo)志物水平異常的發(fā)生要早于臨床癥狀出現(xiàn)[8]，因此檢測腫瘤血清標(biāo)志物的表達(dá)水平可作為乳腺癌早期診斷的方法之一。

BLM是RecQ蛋白家族的重要成員之一，在DNA 修復(fù)、重組及復(fù)制等細(xì)胞過程中均起到重要調(diào)節(jié)作用[9]。有研究報(bào)道多數(shù)乳腺癌患者有BLM 的高度表達(dá)，是檢測乳腺癌的重要腫瘤標(biāo)志物[10]。本研究也顯示乳腺癌患者的血清BLM水平異常上調(diào)，且與BI-RADS 分級呈正相關(guān)，表明BLM水平升高與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。分析其原因可能是由于BLM 基因存在堿基突變所致[11]。

腫瘤標(biāo)志物的單項(xiàng)檢測對惡性腫瘤的診斷效能較低，主要是由于可以在多種腫瘤中檢測到同種腫瘤血清標(biāo)志物的表達(dá)異常，且同種惡性腫瘤中存在眾多腫瘤血清標(biāo)志物的表達(dá)異常[12]。有研究報(bào)道在乳腺良性病變患者中BLM 水平可有不同程度的提高[13]。因此將多種診斷方法聯(lián)合應(yīng)用，在乳腺癌的早期診斷中具有重要的臨床價(jià)值。超聲對于腫塊的細(xì)微結(jié)構(gòu)，如是否存在毛刺、腫塊實(shí)質(zhì)是否存在鈣化及腫塊邊緣的光整程度等均能夠顯示清晰。本研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合血清BLM 檢測的異度、敏感度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值、約登系數(shù)和AUC 值均高于單獨(dú)檢測。分析其原因可能是由于超聲聯(lián)合血清BLM 檢測能夠彌補(bǔ)單一指標(biāo)檢測的不足，使得乳腺癌的診斷正確率得以提高。

綜上所述，乳腺癌患者的血清BLM水平異常上升，超聲聯(lián)合血清BLM檢測在乳腺癌的診斷中具有較高的臨床價(jià)值。但本研究的臨床樣本較少，有待擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步驗(yàn)證。