刮片細胞學檢查聯合術中冰凍在甲狀腺可疑癌結節診斷中的應用價值

劉紅勝，蔡路兵，黃斌，孫麗君

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，目前術中冰凍明確病變性質仍是非常重要的手段。有報道術中快速印片是輔助冰凍診斷的重要指標[1-3]，可以很好的彌補冰凍切片質量差以至于無法準確觀察核特征的局限性。實踐中因結節間質硬化、伴鈣化或退變、壞死以及結節較小等因素，致印片有效成分太少，常不能提供可靠依據。本研究采用對甲狀腺可疑癌結節同步制作印片、刮片與冰凍切片，觀察三者制片中細胞的形態特征，進行術中快速診斷，術后所有病例均經石蠟切片并免疫組化證實，以明確刮片在甲狀腺可疑癌結節術中冰凍診斷中的價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年4 月至2020 年3 月杭州市蕭山區第一人民醫院送檢術中冰凍的甲狀腺外檢標本160例（包括對肉眼可疑癌結節及術前B 超ACR TI-RADS 分級提示4 級及以上結節），其中男48 例，女112 例；年齡21 ～72 歲，中位年齡46 歲。同步制作印片、刮片與冰凍切片，術后均經石蠟切片及免疫組化檢測確診。

1.2 方法

1.2.1 冰凍組織的選取 標本測量體積后垂直于甲狀腺被膜沿最大剖面每隔0.3 cm（腫塊體積小者每隔0.2 cm）書頁狀切開，肉眼可疑癌結節充分取材。對于結節具有明顯包膜者，垂直包膜呈放射狀切開，沿包膜仔細觀察選取與包膜密切相關的區域及包膜外結節。

1.2.2 術中快速印片制作 將清潔玻片與可疑癌結節剖面平行，垂直方向適度輕壓，將印片馬上置于95%乙醇溶液固定30 s，水洗后置蘇木素1 min，自來水洗20 s，0.5%鹽酸乙醇分化，1%氨水溶液藍化10 s，0.25%伊紅溶液3 s，梯度乙醇脫水，松節油透明，中性樹膠封片，完成印片制片約5 min。

1.2.3 術中快速刮片制作 用清潔玻片與可疑癌結節剖面成銳角適度輕刮組織，然后將刮取組織在另一張玻片上成角約30°均勻拖片，制成細胞涂片，立即置于95%乙醇溶液固定30 s，剩余步驟同印片。完成刮片制片約5 min。

1.2.4 術中冰凍切片 根據甲狀腺細胞學Bethesda報告系統（2017 版）[4]進行細胞學診斷，常規石蠟切片制作與免疫組織化學（S-P 法）染色。所選病例術后均經石蠟切片與免疫組化明確診斷，免疫組化所用抗體：甲狀腺轉錄因子1（TTF1）、Tg、CK19、HBME-1、Galectin-3、CD56、CEA、Calcitonin、嗜鉻粒素A（CgA）及Syn，均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 統計方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析，計數資料采用2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料 印片、刮片及聯合術中冰凍切片診斷數據見表1。

表1 印片、刮片及聯合術中冰凍切片診斷數據 例

2.2 石蠟切片檢出情況 石蠟切片共檢出甲狀腺乳頭狀癌124 例[單純型40例，合并橋本氏甲狀腺炎（橋本）45 例，合并結節性甲狀腺腫（結甲）38 例，合并甲狀腺腺瘤1 例]，其中甲狀腺微小乳頭狀癌84 例（占67.7%）；甲狀腺髓樣癌2例（最大徑分別約1.0、0.25 cm）；甲狀腺腺瘤12 例；結甲16 例；亞急性甲狀腺炎6 例。病灶伴乳頭狀結構84 例（52.5%）；伴間質硬化119 例（74.4%）；可見沙礫體25 例(15.6%)；伴鈣化46 例（28.8%）。

2.3 印片檢出情況 印片中甲狀腺乳頭狀癌61 例可見大范圍散在分布的巢狀、小片狀濾泡上皮細胞（封三彩圖3 ～4）。可見核溝、核內假包涵體。少數病例可見模糊的分支狀乳頭樣結構。髓樣癌病例中1例可見少量松散分布的上皮樣細胞，部分細胞短梭形，可見漿細胞樣細胞，胞漿豐富、嗜酸性，部分細胞胞漿透明，背景中可見少量淀粉樣物質。另1 例結節最大徑約0.25cm，可見少數圓形細胞，細胞大小不等，核橢圓形，染色質細膩，胞漿粉染。其余病例未見明確特異性核特征。

2.4 刮片檢出情況 刮片中甲狀腺乳頭狀癌104 例可見局限性密集分布的巢團狀濾泡上皮細胞（封三彩圖5），乳頭狀結構易見（封三彩圖6），部分病例可見濾泡上皮細胞呈旋渦狀結構，核溝、核內假包涵體易見，片狀濾泡上皮細胞核仁明顯，部分病例可見沙礫體，腫瘤細胞與背景甲狀腺正常濾泡上皮細胞對比明顯。背景中部分病例可見炎細胞浸潤，多核巨細胞易見。甲狀腺髓樣癌細胞分兩類：大量松散分布的上皮樣細胞，呈明顯的漿細胞樣（封三彩圖7）或多邊形，細胞核偏位，細胞形態大小差異大，少數為瘤巨細胞，雙核或多核瘤細胞；另一類部分細胞短梭形，小橢圓形，部分細胞可見小核仁。兩類細胞染色質較細膩，胡椒鹽樣。其中1 例可見胞漿內顆粒，背景中淀粉樣物質。甲狀腺腺瘤2 例、結甲4 例可見乳頭狀結構，部分細胞核增大。亞急性甲狀腺炎2 例濾泡上皮細胞核增大，橢圓形，1例似有核溝。

2.5 術中冰凍切片的形態學特征 甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺背景中突然出現明顯異型的腫瘤細胞團巢，與周圍組織無漸進性過渡。大部分見間質硬化及間質浸潤和/或周圍組織浸潤。大部分可見乳頭狀、濾泡狀結構，乳頭具有纖維血管軸心，分支復雜。腫瘤細胞呈柱狀或立方形、胞漿豐富。大部分病例腫瘤細胞可見核增大、核溝及核內假包涵體。核/漿比明顯增大、核形不規則及大小不一。核極性紊亂：可見細胞核不在基底部，移向乳頭表面，位于細胞頂部。核內假包涵體是與胞漿顏色一致的、有銳利增厚邊界的圓形結構，有些病例需仔細尋找。部分病例可找到沙礫體及鈣化。1 例甲狀腺微小乳頭狀癌合并甲狀腺腺瘤，腫瘤位于腺瘤臍凹狀增厚纖維包膜內。

髓樣癌病例中1例可見巢狀、條索狀、腺樣（管狀或濾泡狀）及假乳頭狀結構，細胞圓形、橢圓形，可見漿細胞樣細胞，胞漿豐富，嗜酸性，部分細胞胞漿透明，間質可見纖維組織及淀粉樣物質。另1 例最大徑約0.25cm，腫瘤細胞呈實性巢狀，部分呈濾泡樣，核橢圓形，染色質細膩，未見核溝，可見數個核內假包涵體樣結構（封三彩圖8），胞漿粉染，細胞巢見少量束狀纖維樣結構。

2.6 術后診斷 所有病例均經石蠟制片并免疫組化染色特異性表達明確診斷，甲狀腺乳頭狀癌TTF1（+）、Tg（+）、CK19（+）、HBME-1（+）、Galectin-3（+）、CD56[103 例（－），21 例部分弱（+）]，甲狀腺髓樣癌特異性表達Calcitonin、部分CEA（+）、CgA（+）、Syn（+）。

2.7 印片、刮片及聯合診斷比較 印片155 例，確診106 例，延遲診斷49 例；刮片155 例，確診136 例，延遲19 例；兩組差異有統計學意義（=16.95，P ＜0.05）。印片聯合冰凍切片確診131 例，延遲診斷24 例；刮片聯合冰凍切片確診148 例，延遲診斷7 例；兩組差異有統計學意義（=10.36，P ＜0.05）。

3 討論

甲狀腺癌已成為我國最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤發病第8位[5]。病理形態以乳頭狀癌為主要類型，占甲狀腺癌的79%～94%[6-9]，髓樣癌占甲狀腺癌的5%～10%[10]。由于超聲的分辨率提高，增加了甲狀腺微小癌的檢出率。然而，甲狀腺癌可合并結甲、腺瘤、橋本、亞急性甲狀腺炎及Graves病等良性疾病，為B超檢查判斷病變性質帶來困惑，導致很多病例因結甲、腺瘤等病因手術。在冰凍過程中又因結節小而漏檢，診斷時因合并組織鈣化、間質硬化，或良、惡性腫瘤因相近的組織結構及合并冰凍制片假象等，造成術中診斷困難。故術中冰凍過程中細胞學形態的清晰呈現至關重要。

本研究檢出甲狀腺乳頭狀癌124例，其中甲狀腺微小乳頭狀癌84例，占67.7%，遠遠高于馮紅芳等[5]報道的19.21%。最大徑小于0.3cm 的甲狀腺微小癌往往是在巨檢中偶然發現的，易于遺漏。本組研究漏診5例，均＜0.3cm，2例合并結甲，2例合并橋本，1 例在石蠟切片中檢見，最大徑0.1cm。

甲狀腺髓樣癌因發病率較低，而認識不足，誤診率高。本研究甲狀腺髓樣癌1例最大徑約0.25cm，冰凍切片不除外甲狀腺乳頭狀癌；刮片中細胞呈上皮樣、漿細胞樣，胞漿豐富，染色質細膩，呈胡椒鹽樣；兩者聯合診斷甲狀腺髓樣癌，后經石蠟切片及免疫組化染色Calcitonin陽性予以證實。

本研究印片輔助診斷結果陽性率為84.5%。即使對于巨檢具有明顯乳頭狀外觀的，常規明確診斷甲狀腺乳頭狀癌，仔細閱片可發現印片與刮片兩種制片方式效果差異明顯。很多印片中腫瘤細胞數量較少，不能為診斷提供可靠依據。而采用刮片可以獲得更多可疑癌結節的細胞，更加清晰的顯示核的特征（尤其是含有乳頭狀結構的病例往往可以看到組織結構），刮片輔助診斷結果陽性率為95.5%，其為診斷提供充分依據。

此外，對同一可疑甲狀腺癌結節可以進行多次刮取獲得更多細胞，使具有豐富硬化區及體積較小的病例亦可獲得良好制片。對于結節體積很大及中央區組織硬化、退變、壞死的可疑甲狀腺癌結節，往往在結節邊緣區尚存病變組織或局部病變細胞更活躍，可以在結節邊緣部由內向外呈放射狀刮取。對于具有包膜或界限清晰的病變可以對相鄰可疑癌結節及包膜外結節分別刮取，實現可選擇性的針對性制片。細胞制片時選擇普通玻片，涂片后應立即固定，以防細胞腫脹；染色不可太深，以免影響細胞核結構的觀察。本研究刮片聯合冰凍切片診斷較之單獨冰凍、印片聯合冰凍切片的診斷確診率有明顯提高（均P ＜0.05）。

綜上所述，刮片是一種簡單易行、便捷高效的甲狀腺術中診斷方法，可收集更多細胞，甚至少量組織，便于觀察核特征，為術中冰凍診斷提供更充分可靠的依據。