宮頸鱗狀細胞癌新輔助化療耐藥相關的miRNA分析

王毅軍，陳安兒，史慧薇，鐘惠珍，江元，陳雪珍，施政，鄭晨旸，趙玲軍

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，早期宮頸癌治療以手術為主，而早期巨塊型宮頸癌（局部腫瘤直徑＞4 cm的Ⅰb2 ～Ⅱa2 期）可先行一定療程的化療，待腫瘤病灶縮小后再行切除，以提高手術切除率。部分患者對新輔助化療不敏感，因此新輔助化療前對腫瘤化療敏感性進行預測顯得尤為重要。研究有關新輔助化療敏感性的影響因素和預測方法，以實現“可預見性”的新輔助化療，在目前新輔助化療遠期療效未明的情況下顯得十分必要。miRNA 功能喪失或增強，可導致蛋白水平的表達改變，影響藥物吸收、代謝、分布通道上的基因表達及靶向參與臨床功能，并可能導致持續耐藥。通過研究miRNA 如何影響個體對特定藥物的反應程度，對提高藥物療效和安全性，指導患者的個體化用藥有重要意義。本研究收集接受新輔助化療的巨塊型宮頸癌患者，分析化療敏感組與耐藥組腫瘤組織中miRNA的表達差異，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 組織來源 收集2014 年1 月至2017 年12 月在寧波市婦女兒童醫院采用TC（紫杉醇+卡鉑靜脈化療）方案進行新輔助化療的Ⅰb2 ～Ⅱa2 期宮頸鱗狀細胞癌患者，術前接受2 個療程的新輔助化療。化療療效評價標準：（1）完全緩解（CR）：肉眼觀腫瘤完全消失，且無新病灶；（2）部分緩解（PR）：腫瘤縮小≥50%，且無新病灶；（3）病情穩定（SD）：腫瘤縮小＜50%，無新病灶；（4）病情進展（PD）：腫瘤無縮小或有新病灶。CR 和PR 歸為有效（敏感），SD和PD歸為無效（耐藥）。根據化療的療效將患者分為新輔助化療敏感組和耐藥組，其中敏感組4 例和耐藥組3 例，將兩組腫瘤組織進行miRNA芯片檢測。所有參與患者在參加本實驗前均簽署知情同意書，醫院倫理委員會批準了本次實驗所有樣本的使用協議。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：RNA 6000 納米試劑盒（Agilent）、ULSTMmicro-RNA 標記試劑盒（kreatech）、截留分子量100K 的超濾離心管（Pall Corp）、超濾離心濃縮管（GE）、無RNA酶水（Sigma）、預雜交溶液、雜交試劑盒、microRNA 微陣列、基因表達洗滌Buffe I、基因表達洗滌Buffe II、基因表達洗滌Buffe III（Phalanx）。主要儀器：微小RNA 表達芯片（miRNA OneArrayTM 芯片，臺灣華聯生物）、2100 生物分析儀（Agilent）、超微量分光光度計（Thermo Fisher）、凝膠記錄系統（Alpha Innotech）、微量離心儀（Eppendorf）、PCR 系統（Applied Biosystems）、雜交爐（COCONO）、微陣列掃描儀（MolecularDevices Corporation）、恒溫箱（Benchmark）。

1.3 方法

1.3.1 組織標本的采集與保存 宮頸癌組織標本是在患者化療前留取，并經病理組織學證實，標本離體后存放于－ 80 ℃低溫冰箱中保存。

1.3.2 miRNA 芯片實驗步驟

1.3.2.1 RNA提取及質檢 選取每份樣本組織約100mg，用Trizol法提取總RNA，經質檢完好，每一樣品的總RNA含量需5 g以上、OD 260/OD 280≥1.6、OD 260/OD 230≥1.0達到標準，即進行標記雜交試驗。

1.3.2.2 微小核酸分離純化 利用NanoSep?100K 的孔徑分離微小RNA，將大片段核酸保留于管柱中，離心過的小片段核酸即為純化后的微小核酸（＜200nt）。

1.3.2.3 ULS熒光標定步驟 將ULS試劑劇烈震蕩混和后離心，冰上備用；將分離純化后的小核酸溶液，加入10×ULS標定溶液，混和后離心；置于PCR 上，設定85 ℃，15 min，置于冰上待純化；將K REApure TM管柱取出，旋開1/4圈轉蓋，將管柱下方封口折斷置入2 ml 收集管，13000r/min 離心1min，去除離心后收集管內溶液；加入300 l 純水，13 000 r/min離心1 min；拋棄2 ml 收集管及溶液，將KREApureTM管柱置入1.5ml離心小管；加入小核酸溶液于管柱上，13000r/min離心1min 后拋棄管柱，測定溶液熒光吸收光譜（OD），計算熒光標定值，避光置于冰上，等待雜交反應。

1.3.2.4 miRNA 芯片（miRNA OneArray TM）反應流程（1）前雜交處理：將芯片置入無水酒精，靜置20 s；取出置入Ebox，用純水清洗，上下搖晃3min，置入已預熱好的前雜交溶液，于42 ℃烘箱靜置2h；取出置入已裝入新鮮純水的E-box清洗，上下搖晃3 min 后，取出芯片離心甩干，避光備用。（2）雜交反應：miRNA 芯片完成前雜交反應后，與具有黏性的On eArrayDouble Chamber黏合，黏合區域須符合探針布放區域，并翻轉確認Chamber膠框完全密合；將熒光標定的小核酸樣品與2×miRNA OneArray Hyb Buffer 混合，并加入適量純水至總體積為90 l。樣品進行PCR 加熱，95℃，2min，從一端樣品注入口加入樣品，注入后將注入口以圓形黏性貼將Chamber 兩端封口。將芯片置于37 ℃雜交烘箱中，2 r/min 垂直轉速，14 ～16 h。將芯片取出，予37 ℃清洗溶液（buffer I）進行拆除Chamber，然后按如下步驟清洗，bufferI37℃,80r/min，5min；buffer II 37 ℃，80 r/min，5 min；再進行一次buffer II 25℃5 min 后，以buffer III 室溫5 min 清洗，最后再離心將芯片甩干。避光，AXON4000B 熒光掃描儀掃描。

1.4 統計方法 采用SAM 4.01 微陣列顯著性分析軟件進行分析，采用IPA 軟件分析其相關的靶基因，構建micro-RNA-基因網絡圖，數據比較采用t檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異miRNA 篩選結果 敏感組與耐藥組有14 個miRNA表達差異均有統計學意義（均P ＜0.05），其中有12 個miRNA在TC方案新輔助化療耐藥組中表達上調，2 個miRNA 表達下調，兩組倍比變化在－ 0.69 ～2.61，見表1 ～2，差異表達miRNA 聚類圖見封三彩圖1。

表1 在耐藥組中表達上調的miRNA

2.2 目標miRNAs 的選擇 IPA 網絡調控分析發現參與該調控網絡的關鍵分子主要有PTEN、TRPS1、FBXW7、BAP1、ZEB2、RB1、TP53、CDKN2A、TGFBR2、CSF1、CTNNB1、CDK4、TIMP3、FAS。本研究耐藥組中表達上調的12 個miRNA 中有4 個miRNA（hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-21-5p、hsamiR-26a-5p、hsa-miR-92a-3p）的靶基因是PTEN。在耐藥組中上調表達的miR-21-5p、miR-24-3p、miR-34c-5p參與Notch信號通路的調節，Notch信號通路是調控網絡主要信號通路之一（封三彩圖2）。

3 討論

宮頸癌是女性發病率最高的惡性腫瘤之一，年輕的巨塊型宮頸癌患者可行新輔助化療，再行手術治療，但是存在部分耐藥的患者。因此尋找與新輔助化療敏感性相關的腫瘤標志物顯得十分重要，本實驗對新輔助化療敏感組和耐藥組宮頸癌組織進行微小RNA 表達芯片檢測，比較差異表達的miRNA，預測其靶基因，為篩選出與新輔助化療耐藥相關的分子標記物打下基礎。

miRNAs 是一類內源性非編碼單鏈小RNA，調控細胞的多種功能，參與細胞藥物代謝過程，這說明其可能與化療藥物敏感性相關。Huang 等[1]報道，miR-15a和miR-16 表達上調能明顯增強化療藥物喜樹堿（CPT）引起的Hela細胞的自噬和凋亡，miR-15a/16 能誘導自噬而抑制宮頸癌細胞的增殖，增強CPT 的化療作用。本研究結果發現其中有12 個miRNA 在化療耐藥組中表達上調，2 個miRNA 表達下調，其中在耐藥組中上調表達的4 個miRNA在惡性腫瘤中研究的比較多，分別是miR-200c-3p、miR-21-5p、miR-26a-5p、miR-92a-3p，這提示其可能參與調控宮頸癌新輔助化療耐藥。

miRNA 對細胞功能有重要的調控作用，與腫瘤的轉移、侵襲、凋亡及增殖等密切相關，并通過與上、下游基因之間的調控影響腫瘤細胞對化療及放療的敏感性[2-3]，研究發現miR-200c與惡性腫瘤的發生發展、侵襲轉移及化療耐藥等密切相關[4]。本研究在miRNA 芯片篩選的基礎上，根據兩組中差異表達的miRNA，獲得與宮頸癌新輔助化療耐藥相關的基因列表，通過IPA 預測miRNA相關的靶基因，和miRNA一起構建miRNA-基因網絡圖。本研究結果發現耐藥組中表達上調的12個miRNA中有4個miRNA（hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-21-5p、hsamiR-26a-5p、hsa-miR-92a-3p）的靶基因是PTEN，PTEN是其中重要的分子。PTEN是一種抑癌基因，其異常表達還與腫瘤的多藥耐藥密切相關。有研究表明，在卵巢癌細胞株C13K中，miRNA-214與PTEN非編碼區結合，下調PTEN蛋白的表達，導致細胞對順鉑耐藥[5]。還有研究表明腫瘤細胞對順鉑、多柔比星、紫杉醇等化療藥物耐藥的關鍵因素之一是激活了PI3K/Akt，PI3K 抑制劑可以逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥，而PTEN是調控PI3K/Akt 通路的重要基因[6]。這提示PTEN 可能參與調控宮頸鱗狀細胞癌新輔助化療耐藥。

表2 在耐藥組中表達下調的miRNA

本研究通過IPA 分析發現在耐藥組中上調表達的miR-21-5p、miR-24-3p、miR-34c-5p 參與Notch 信號通路的調節，miR-21-5p參與了Notch信號通路的調控，miR-24-3p 的靶基因FURIN 參與了Notch信號通路的調控，miR-34-5p的靶基因Notch1、Notch2、DLL1、JAG1，其中Notch-1、Notch-2 是Notch受體，DLL1、JAG1 是Notch 配體，NOTCH 信號通路是調控網絡主要信號通路之一。Notch 通路與PI3K/AKT通路之間的相互作用在腫瘤中成為研究熱點。有研究發現聯系PI3K/AKT、Notch 通路之間的一個重要節點是PTEN，不同的Notch 分子對PTEN 的作用及所產生的生物學效應也并不相同[7]。這提示PTEN 和Notch信號通路可能參與調控宮頸鱗狀細胞癌TC 方案新輔助化療耐藥，但其具體的作用及調控方式尚需在體外細胞實驗及動物體內實驗中進一步證實。

綜上所述，對這些差異表達的miRNA、其靶基因及參與調控的信號通路進行深入的研究，有助于進一步了解化療耐藥的分子機制，為尋找耐藥相關的分子標志物和基因治療的新靶點提供依據。