肝爽顆粒對肝損傷大鼠的保護作用

白璐，馬英杰，王郁杰

內毒素是指革蘭陰性菌細胞壁中的脂多糖，當細菌裂解或是黏附在其他細胞上時會釋放脂多糖，脂多糖含量增加會激活體內炎性反應，參與多種疾病進展。機體清除內毒素的主要器官為肝臟，肝臟也最容易受到內毒素誘導損傷，內毒素誘導的肝臟損傷是多種肝臟疾病的基礎病理因素。現已有研究顯示內毒素誘導的肝臟損傷可以激活多種介導炎癥反應的信號通路，表明炎癥反應是肝臟組織損傷的重要病理機制。TLR4/NF-кB 信號通路為重要的介導炎癥反應的重要信號通路之一，在誘導細胞炎癥反應、增加炎性因子水平的過程中具有重要作用，通過抑制該信號通路的傳遞，能夠明顯降低機體組織細胞的炎癥反應進程。肝爽顆粒主要是由黨參、柴胡、白芍、當歸、茯苓、白術、枳殼、蒲公英、虎杖、夏枯草、丹參、桃仁、鱉甲組成，具有疏肝健脾、清熱散淤、保肝護肝、軟堅散結的作用，多用于急慢性肝炎、肝硬化以及肝功能損傷臨床治療。肝爽顆粒對肝組織損傷有明顯減輕作用，同時還體現出保肝抗炎的功效，能夠抑制mTOR信號通路，抑制肝星狀細胞活性，實現抗肝纖維化的功能。肝爽顆粒對肝損傷的保護作用是否可以通過影響TLR4/NF-кB 信號通路傳遞來發揮其功能，尚不清楚。因此，本研究自2019 年5―10 月通過肝損傷大鼠模型來探索肝爽顆粒對其可能存在的作用機制，為肝爽顆粒用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

肝爽顆粒（保定天浩制藥有限公司，批號Z20027671）、LPS（L4391）、D-GalN（G0500）均購于美國Sigma 公司，白介素-1β（IL-1β）酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒（YAD23684S，北京杰輝博高生物技術有限公司），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）ELISA 試劑盒（SBJ-R0785，南京森貝伽生物科技有限公司），白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（JK-a-0023）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒［JK-（a）-1752）均購于上海晶抗生物工程有限公司］，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（QYBM10200，上海喬羽生物科技有限公司），丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（0-100860，上海將來實業股份有限公司），原位末端標記法（TUNEL）凋亡試劑盒（T2190，上海恒斐生物科技有限公司），Bcl-2相關X（Bax）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、TLR4、Myd88、核因子κB（NF-κB）抗體購于武漢博歐特生物科技有限公司。

熒光顯微鏡（DMi8-電動，徠卡），離心機（5430/5430R，Eppendorf），石蠟切片機（Finesse ME+，賽默飛）。

1.2 動物及分組

SPF 級SD 雄性健康大鼠50 只，4～5 周齡，體質量（190±20）g，購于湖南嘉泰實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（湘）2015-0006，購回后適應性飼養1 周，培育室溫度為20～25 ℃，濕度40%～50%，人工光照晝夜時間各12 h，飲水自由。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。將50 只SD 大鼠采用隨機數字表法均分成5 組，分別為對照組、模型組、肝爽顆粒低劑量組、肝爽顆粒中劑量組、肝爽顆粒高劑量組。

1.3 實驗方法

肝爽顆粒低劑量組、肝爽顆粒中劑量組、肝爽顆粒高劑量組分別灌胃1.8 g/kg、3.6 g/kg、7.2 g/kg 肝爽顆粒，1 次/天，連續灌胃1 周；對照組、模型組灌胃等體積生理鹽水，1 次/天，連續灌胃1周，末次給藥后1 h，用于肝損傷大鼠模型制備。

肝損傷大鼠模型制備方法參考文獻，模型制備前禁食12 h，飲水自由，腹腔注射LPS（20 μg/kg）、D-GalN（400 mg/kg），對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，造模12 h后，進行各指標檢測。

1.4 指標檢測

腹腔注射LPS（20 μg/kg）、D-GalN（400 mg/kg）12 h 后，麻醉處死大鼠，取出肝臟組織，一部分肝臟組織制備成肝臟勻漿，用于檢測肝臟組織中的MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平；一部分肝臟組織用于細胞凋亡、TLR4/NF-кB 信號通路相關蛋白水平檢測。

1.5 TUNEL 檢測

將已固定好的肝臟組織，經脫水、透明、浸蠟、包埋，5 μm 切片，參考TUNEL 試劑盒說明書步驟進行肝臟組織凋亡檢測，在光學顯微鏡下隨機選取5 個不重疊視野，記錄100 個細胞中的陽性細胞數目，陽性細胞表現為棕黃色或棕褐色的細胞核，計算出細胞凋亡率，細胞凋亡率=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測

提取肝臟組織總蛋白，調整蛋白質濃度，經SDS-PAGE 電泳、轉移至PVDF 膜，加入Bax、Bcl-2、TLR4、Myd88、NF-κB、β-actin 一抗，于4 ℃條件下孵育過夜，再用TBST 漂洗40 min，分為3 次漂洗，再加入經HRP 標記的二抗繼續孵育1 h，根據ECL試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進行蛋白條帶分析。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織凋亡情況比較

取各組大鼠肝臟組織進行TUNEL 檢測，比較各組大鼠肝臟組織細胞凋亡率。結果顯示，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組大鼠肝臟組織細胞凋亡率明顯高于對照組（

P

<0.05）；1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組大鼠肝臟組織細胞凋亡率均明顯低于模型組（

P

<0.05），且隨著肝爽顆粒劑量逐漸增加，大鼠肝臟組織細胞凋亡率逐漸降低，見圖1、表1。

表1 各組大鼠肝臟組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cas?pase-3）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X（Bax）蛋白水平及凋亡率比較/（%，± s）

圖1 各組肝臟組織TUNEL檢測結果（TUNEL×200）：A為對照組；B為模型組；C為1.8 g/kg肝爽顆粒組；D為3.6 g/kg肝爽顆粒組；E為7.2 g/kg肝爽顆粒組

采用Western blotting 檢測各組大鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2蛋白水平，結果顯示，與對照組相比，模型組與1.8 g/kg肝爽顆粒組、3.6 g/kg肝爽顆粒組、7.2 g/kg肝爽顆粒組大鼠肝臟組織中Bax蛋白含量均明顯升高（

P

<0.05），Bcl-2 蛋白水平均顯著降低（

P

<0.05）；與模型相比1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組大鼠肝臟組織中Bax蛋白水平降低（

P

<0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（

P

<0.05），見圖2、表1。

圖2 各組肝臟組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Bax、Bcl-2蛋白水平凝膠成像結果

2.2 各組大鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 水平比較

將各組大鼠肝臟組織制備成肝臟組織勻漿，經離心取上清液，采用ELISA 法檢測各組大鼠肝臟組織中MDA、SOD、GSH-Px水平。結果顯示，與對照組相比，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組MDA 含量增加（

P

<0.05），SOD、GSH-Px活性降低（

P

<0.05）；與模型相比，1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組MDA 含量降低（

P

<0.05），而SOD、GSH-Px 活性升高（

P

<0.05），且隨著肝爽顆粒給藥劑量增加，這種趨勢更明顯，見表2。

表2 各組大鼠肝臟組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）比較/± s

2.3 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量比較

取各組大鼠肝臟組織制備成肝臟組織勻漿，經離心取上清液，采用ELISA 法檢測各組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。結果顯示，與對照組相比，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg肝爽顆粒組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯增加（

P

<0.05）；與模型相比，1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg肝爽顆粒組、7.2 g/kg肝爽顆粒組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均明顯降低（

P

<0.05），且隨著肝爽顆粒給藥劑量增加，降低趨勢更明顯，見表3。

表3 各組大鼠肝臟組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）含量比較/± s

2.4 肝爽顆粒對肝損傷大鼠TLR4/NF-кB 信號通路的影響

提取各組大鼠肝臟組織總蛋白，采用Western blotting 檢測各組組織中的TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平。結果顯示，與對照組相比，模型組、1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平均明顯升高（

P

<0.05）；與模型組相比，1.8 g/kg 肝爽顆粒組、3.6 g/kg 肝爽顆粒組、7.2 g/kg 肝爽顆粒組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平均明顯降低，且隨著肝爽顆粒給藥劑量增加，降低趨勢更明顯，見圖3、表4。

表4 各組大鼠肝臟組織TLR4、MyD88、核因子κB（NF-κB）蛋白水平比較/（%，± s）

圖3 各組肝臟組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白凝膠成像結果

3 討論

急性肝損傷為多種肝病進展為肝功能衰竭的中間環節，引起急性肝損傷的因素眾多，常見因素有肝組織缺氧缺血、代謝異常、中毒及感染等。我國病毒性肝炎患者較多，LSP 是誘導肝損傷的重要因素，能夠激活單核巨噬細胞產生大量的炎性因子，使機體組織器官產生損傷。D-GalN 是核苷酸干擾劑，能夠阻礙肝臟組織細胞尿苷三磷酸合成，引起肝臟組織炎癥反應與組織壞死，降低肝臟對LPS的解毒功能，加重機體肝組織損傷，這點與病毒性肝炎病理特點相似。因此，本研究選擇LPS/DGalN腹腔注射來制備急性肝損傷大鼠模型。

Liu 等研究發現肝爽顆粒可以通過抑制小鼠模型中的調節性T細胞對肝硬化的保護作用。本研究發現LPS/D-GalN 可以促進大鼠肝組織凋亡，降低Bcl-2 蛋白水平，增加Bax 蛋白含量，肝爽顆粒預處理可以降低肝損傷大鼠肝組織細胞凋亡率，升高Bcl-2 蛋白水平，降低Bax 蛋白含量。線粒體途徑在細胞凋亡途徑中具有重要作用，其結構及功能受損，使線粒體膜電位下降，激活Caspase-9，使Cas?pase-3 蛋白含量增加，加快細胞凋亡。Bcl-2 家族為由線粒體途介導的細胞凋亡的是重要的調節因素，Bcl-2 含量增加可以抑制細胞凋亡，Bax 含量增加促進細胞凋亡。王晶等認為黨參水提取物可以穩定D-半乳糖致衰小鼠肝脾結構，降低Bax 蛋白水平，抑制細胞凋亡，對小鼠肝脾組織有明顯的保護作用。黨參為肝爽顆粒中藥組成之一，本研究結果與前人研究結果趨勢相似，表明肝爽顆粒對肝損傷大鼠的肝臟組織細胞凋亡有抑制作用，可能是通過促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達有關。

LPS/D-GalN 誘導的急性肝損傷會激活巨噬細胞產生大量炎性因子，還能引起肝組織細胞凋亡。本研究結果顯示模型組大鼠肝臟組織細胞凋亡率明顯增加，且肝臟組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 活性明顯減低。SOD活性降低會使細胞膜不飽和雙鍵結構容易受自由基破壞，促進脂質分解產生MDA，引起線粒體膜的通透性發生改變，影響線粒體功能。GSH-Px可以清除活性氧誘導的脂質過氧化物，促進過氧化氫的分解，保護細胞的膜結構及其功能的完整。TNF-α、IL-1β、IL-6 是典型的炎性因子，其水平變化也反映了機體的炎性反應情況。肝爽顆粒中的丹參總酚酸可以對小鼠急性肝損傷有保護作用，可以降低小鼠血清IL-6、TNF-α 水平。柴胡也是肝爽顆粒的中藥成分，有研究顯示柴胡皂苷-b2 可以降低由四氯化碳引起急性小鼠肝損傷，可以降低小鼠MDA水平，增加SOD 活性，推測其保護肝組織損傷作用機制可能是通過改善氧化應激損傷有關。本研究結果與前人研究結果趨勢相似，由此推測肝爽顆粒對大鼠急性肝損害的改善作用，也可能是通過緩解LPS/D-GalN 誘導大鼠的肝組織炎癥反應與氧化應激來實現。

肝臟巨噬細胞可以分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 炎性因子，TNF-α、IL-1β、IL-6 一方面可以通過作用于肝細胞表面受體，促進肝臟細胞壞死，另一方面還可以激活NF-кB 信號通路，以正反饋方式促進其自身含量增加，進一步加劇肝臟組織損傷。本研究結果顯示，由LPS/D-GalN 誘導的急性肝損傷大鼠肝臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白水平明顯增加，而肝爽顆粒可以抑制這種增長趨勢。NF-кB信號通路是介導機體肝臟組織炎性反應的重要作用途徑，中TLR4、MyD88、NF-κB 在肝臟組織炎性反應中有協同作用。脂多糖可以激活TLR4 信號，激活TLR4下游的MyD88，引起肝臟組織炎性反應并釋放炎性因子。MyD88既是TLR4的轉接蛋白，又為NF-кB連接蛋白，胞外炎癥信號通過TLR4 傳遞給MyD88，促使MyD88與IRAK4相互作用，使IRAK4磷酸化并作用于TAB-1/TAB-2，激活TAB-1，再接著作用于NF-κB，激活IκB 激酶。在上游信號后刺激后，在IKK 作用下IκB 磷酸化激活，可進一步釋放炎性細胞因子，炎性因子含量增加又可進一步激活NF-κB，因此TLR4-MyD88-NF-κB 信號通路在肝臟炎癥反應中具有重要作用。李文燕等研究顯示樟芝多糖可以通過下調TLR4-MyD88-NF-κB 表達來降低LPS/D-GalN 誘導的肝細胞凋亡以及急性肝損傷，同時在免疫組化實驗中也發現肝損傷中NF-кB信號呈現出激活狀態。Zhang 等研究顯示LPS 低劑量連續預處理可以改善LPS/D-GalN 誘導的急性肝衰竭，起作用機制是通過抑制NF-кB 信號通路活化，從而有助于肝臟抵抗LPS/D-GalN 誘導的肝損傷。本研究結果與前人研究結果相似，由此推測，肝爽顆粒對LPS/D-GalN 誘導的大鼠急性肝損傷的保護作用，可能是通過抑制TLR4/NF-кB 信號通路活化，從而減少大鼠肝組織損傷，降低肝組織炎性反應。

綜上所述，肝爽顆粒可能是通過降低Bax 蛋白水平，增加Bcl-2蛋白水平來降低急性肝損傷大鼠肝組織細胞凋亡率；還可以降低肝臟組織TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平，增強SOD、GSH-Px活性，增強大鼠機體抗氧化應激、抗炎性能力，可能與抑制TLR4/NF-кB 信號通路有關，實現對肝臟組織結構及功能的保護作用。本研究所得結論僅限于大鼠動物實驗，其他種類動物或臨床上是否具有相似的趨勢，還需要進一步研究。