重組人干擾素γ對變應性鼻炎大鼠Toll樣受體4/核因子-B信號通路及血清炎癥因子的影響

陸智蕓，許水森，農應全

變應性鼻炎（AR）是變應原吸入機體后造成T淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，免疫球蛋白E（IgE）所介導免疫細胞將化學遞質釋放后引發的變態反應炎性疾病，臨床表現噴嚏、鼻黏膜腫脹及鼻癢等。相關流行病學研究顯示，國內AR發病率逐年升高，已是臨床主要呼吸道疾病之一。當前，臨床對AR 治療主要為白三烯受體拮抗劑、抗組胺類及糖皮質激素等藥物，關于重組人干擾素γ（IFN-γ）對AR治療機制研究較少。在AR致敏與激發階段中IgE有重要影響，有報道稱，AR 疾病嚴重程度和IgE 含量呈正相關。IFN-γ 作為巨噬細胞活化因子，由活化Th1細胞所分泌，可對IgE所介導變態反應拮抗，有免疫調節作用。Toll樣受體（TLRs）為主要免疫受體，對不同病原體識別并啟動不同信號傳導通路，在機體獲得性與先天性免疫中有重要影響。NF-B在幾乎所有細胞內均存在，對細胞生長發育及機體的免疫應答、炎癥反應可起到重要作用，在變應性疾病中，核因子- B（NF-B）參與嗜酸性粒細胞的浸潤、遷移和生長等，并使相關細胞因子激活，對嗜酸性粒細胞凋亡抑制；還可加速白細胞介素-5（IL-5）、IL-4等Th2相關細胞因子表達，抑制IFN-γ等Th1相關細胞表達，對Th1/Th2平衡影響。因此，本研究自2019年5―11月分析重組人干擾素γ對AR大鼠TLR4/NF-B信號通路及炎癥因子影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠

SPF級雄性大鼠60只，6周齡，購自成都達碩實驗動物公司，許可證號：SCXK（川）：2019-29，體質量（106.17±8.52）g，范圍為90～120g。常規飼養1周后開始實驗。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

藥物、試劑：注射用重組人IFN-γ（規格：50 萬IU/瓶子，麗珠生物工程制藥公司），4% 多聚甲醛（北京索萊寶科技公司），雞卵清蛋白Ⅴ級（美國Sigma-Aldrich 公司），PCR 試劑盒（日本Takara 公司），IFN-γ、IgE、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-4、IL-6 及IL-10（欣博盛生物科技公司），RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司），NF-B、TLR4 抗體（美國Cell signling 公司）。儀器：雙垂直電泳槽（型號DYCZ-24D，北京六一儀器廠），臺式高速離心機（型號Allegra X-30R，美國貝克曼庫爾特公司），轉印電泳槽（型號DYCZ-40D，北京六一儀器廠），MODEL550 酶標儀（美國BIO-RAD 公司），恒溫水浴鍋（上海福瑪實驗設備公司）。

1.3 研究方法

隨機數字表法將大鼠分為實驗組、正常組與模型組，每組20 只，模型組與實驗組大鼠依據劉敏等方法制備AR 模型，1 mL 生理鹽水內溶解0.3 mg卵清白蛋白（抗原）與30 mg AI（OH）（佐劑）制備為混懸液，腹腔注射以基礎致敏，每次注射間隔1 d，共持續注射8 次。第16 天起，使用微量加樣器將劑量為10 mg/100 L 的卵清白蛋白經鼻滴入50 L，持續7 d強化致敏。末次治療后觀察30 min內大鼠的打噴嚏與撓鼻狀況，按照行為學指標評分，成功造模為評分≥5分。由第22天建立模型后，依據人和動物劑量轉換公式，實驗組大鼠采用20 IU 的重組人IFN-γ 滴鼻治療，1 次/天，正常組與模型組采用等劑量生理鹽水滴鼻，持續14 d。

1.4 觀察指標

（1）行為學評分：各組大鼠由基礎致敏到停止給藥5 周內，在每周的末次給藥0、0.5、1、2 h 對大鼠行為進行觀察，依據行為學評分標準評分：不停擦鼻，清涕流至面部，噴嚏數≥11個計3分；兩前肢撓鼻，清涕超出前鼻孔，噴嚏數4～10 個計2 分；單前肢偶有撓鼻，清涕流至前鼻孔，噴嚏數1～3 個計1分。（2）檢測鼻黏膜組織：末次給藥后處死大鼠，采用鼻腔暴露法將大鼠鼻腔外側壁與鼻中隔呼吸區黏膜組織快速取出，10% 甲醛固定后酒精梯度脫水、透明，包埋后切片，厚度4 m，常規行HE 染色，觀察大鼠鼻黏膜組織病理狀況；每張病理切片隨機選取高倍視野（10×40）5 個，計算大鼠鼻黏膜內肥大細胞與嗜酸粒細胞數量。（3）末次給藥后，采集大鼠腹主動脈血清，室溫下放置1 h，而后4 ℃、2 500 r/mim 離心10 min，選取上清液放置于EP管內，ELISA法檢測血清IL-10、IFN-γ、IL-6、IgE、TNF-α、IL-4 含量。（4）RTPCR 檢測鼻黏膜組織TLR4 與NF-B p65 mRNA 相對表達量：Trizol 提取細胞總RNA，TLR4 正向引物5’-GATCTAGCATCAGCTGTAC，反 向 引 物5’-GCAT?CATCGTACGATCGAT-3’；NF-B p65 正向引物5’-GATCGATCAGTAGTCATGA-3’，反 向 引 物5’-GTAGCTCGATCGATCAGTC-3’；內參β-actin 正向引物5’-GACTAGCATCGATCATTA-3’，反向引物5’-GATCATGCTAGCATCTAGA-3’。 PCR 反應條件：92 ℃40 s，55 ℃450 s，74 ℃70 s，循環40 次后取TLR4與NF-B p65 mRNA 循環閾值（Ct），ΔΔCt（ΔΔCt=Ct 目的基因－ΔCt 內參基因）分析，計算2目的基因相對表達量。（5）蛋白質印跡法（Western blot?ting）檢測各組大鼠鼻黏膜組織內TLR4 與NF-B p65蛋白表達：常規提取細胞總蛋白，上樣電泳，80 V 電壓，溴酚藍染料至分離膠提高電壓為100 V，分離膠下泳出溴酚藍結束電泳。PVDF膜內蛋白質電轉移，30 mA 恒流，持續80 min。5%TBST 脫脂奶粉封閉PVDF 膜，震蕩50 min。封閉結束后洗膜3 次， 10分鐘/次，膜移至雜交袋，置入漂洗液稀釋抗體，孵育過夜。洗膜3 次，10 分鐘/次，置入過氧化物酶標記二抗，震蕩50 min。ECL 顯色液中將PVDF 膜溫育6 min，分別曝光、顯影、定影。沖洗后晾干掃描。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分情況

實驗組與模型組大鼠在基礎致敏階段狀態良好，排便與飲食、飲水正常；藥物激發3 d 后，實驗組與模型組大鼠表征為毛發凌亂、煩躁易驚，激發完成后大鼠前鼻孔流出大量鼻涕，用前爪頻繁撓鼻并打噴嚏，2 h 后部分大鼠癥狀有所緩解。強化致敏7 d 完成后，實驗組大鼠行為學評分為（7.68±1.52）分，模型組為（7.81±1.43）分，均高于正常組的（2.95±0.57）分，差異有統計學意義（均

P

<0.05），說明成功建模。末次給藥后實驗組大鼠流涕、噴嚏和撓鼻等狀況較模型組顯著好轉，行為學評分降低至（3.98±0.64）分，較模型組的（8.49±1.53）分差異有統計學意義（

P

<0.05）。

2.2 各組大鼠鼻黏膜病理狀況

和正常組相比，模型組大鼠其鼻黏膜的假復層纖毛柱狀上皮呈現連續性中斷，纖毛發生倒伏且部分脫落，腺管變粗，基底細胞與柱狀細胞剝脫，腺體變多，固有層內結締組織增生，杯狀細胞增生，并伴隨大量炎癥細胞浸潤。實驗組大鼠較模型組鼻黏膜上皮顯著好轉，固有層內炎癥細胞數量大幅降低，肥大杯狀細胞減少，擴張腺管與腺體接近正常。

2.3 各組大鼠鼻黏膜內肥大細胞與嗜酸粒細胞數量情況

模型組大鼠鼻黏膜內肥大細胞、嗜酸粒細胞數量較正常組升高，實驗組大鼠鼻黏膜內肥大細胞、嗜酸粒細胞數量較模型組降低（

P

<0.05），見表1。

表1 各組大鼠鼻黏膜內肥大細胞與嗜酸粒細胞數量/（個/高倍視野，± s）

2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量情況

模型組大鼠血清IFN-γ、IL-10 含量低于正常組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量高于正常組；實驗組大鼠血清IFN-γ、IL-10 含量高于模型組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量低于模型組（

P

<0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子含量對比/（ng/L，± s）

2.5 各組大鼠鼻黏膜組織TLR4 與NF-B p65 mRNA 表達情況

模型組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 mRNA 相對表達量較正常組升高，實驗組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 mRNA相對表達量較模型組降低，差異有統計學意義（

P

<0.05），見表3。

表3 大鼠鼻黏膜組織TLR4與NF-B p65 mRNA表達對比/± s

2.6 各組大鼠鼻黏膜組織TLR4 與NF-B p65 蛋白表達情況

模型組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65蛋白表達較正常組升高，實驗組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 蛋白表達較模型組降低，差異有統計學意義（

P

<0.05），見表4。

表4 各組大鼠鼻黏膜組織TLR4與NF-B p65蛋白表達對比/± s

3 討論

重組人IFN-γ 為一種生物制劑，多用于肝纖維化和類風濕關節炎等治療，近些年來逐漸應用于AR 的治療，其對于臨床AR 病人有一定療效，但相關機制研究較少。機體免疫內TLR 為哺乳動物細胞唯一能夠把細胞外抗原信息傳遞至細胞內的跨膜蛋白，對識別病原體有重要的影響。TLR 多在哺乳動物免疫細胞表面表達，可對病原微生物生化內特定病原體特異性識別。呼吸道鼻黏膜內黏膜內皮細胞、樹突狀細胞、黏膜上皮細胞與巨噬細胞等分布著不同TLR 的亞型，而不同亞型對于特定微生物的感染源形成免疫應答。致敏原接觸特應性個體后造成Th1/Th2 細胞因子網絡的不平衡，在疾病發生中Th2 型細胞因子表達量升高，對疾病發生有重要影響。相關研究顯示，采用脂多糖刺激哮喘小鼠，其機體內Th2含量明顯升高，但在敲除TLR4 基因小鼠內Th2 含量卻未明顯上升。同時，TLR4 活化將NF-B 通路激活，NF-B 通路為介導細胞信號傳遞關鍵核轉錄因子，可經炎性介質、炎性相關因子和免疫調節間級聯放大瀑布效應，在免疫反應與炎性反應中起到樞紐作用，對機體內多個信號通路傳導有關鍵影響，參與了多種基因的調控與表達。

有報道稱在AR 發病過程中TLR4/NF-B 信號通路起到了重要影響，TLR4 結合外源性配體將TLR4-MyD88 依賴性途徑活化，激活NF-B 通路。NF-B亞基p65活化后可對轉錄元件直接作用將轉錄過程激活，進而啟動系列免疫相關基因，包含趨化因子、黏附分子及前炎性介質等轉錄過程，增大其表達量，促進炎性細胞的浸潤，加重或誘發炎癥反應。另外，NF-B p65 活化后可將核內相關基因表達啟動，造成Th1/Th2 失衡，Th2 細胞比例升高。本文研究顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 蛋白與mRNA 表達較正常組升高，實驗組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65蛋白與mRNA表達較模型組降低，差異有統計學意義，說明重組人IFN-γ 可阻斷AR 大鼠機體內TLR4/NF-B 信號通路的轉導。AR 發生主要因素為Th1/Th2 失衡，其中Th2 可形成IL-10、IL-4 等細胞因子，介導體液免疫反應，Th1 則釋放IFN-γ、IL-2 等，參與細胞免疫應答，Th1 所產生IFN-γ 是主要抗炎因子，抑制機體內IgE。而Th2 所形成的IL-4 等對變應性炎癥反應有廣泛影響，包括產生肥大細胞、形成黏液、嗜酸性粒細胞成熟、氣道高反應性及生成IgE 等，同時，IL-4 可刺激IgE 基因重組與IgE 信使的RNA 轉錄，增大B 細胞所產生IgE的舒朗，機體免疫系統對于小量抗原的刺激發生免疫應答。本文研究顯示，模型組大鼠血清IFNγ、IL-10 含量低于正常組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量高于正常組；實驗組大鼠血清IFN-γ、IL-10含量高于模型組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量低于模型組，差異有統計學意義，說明重組人IFN-γ 可抑制炎癥因子表達，糾正Th1/Th2的失衡狀態。

綜上所述，重組人干擾素γ 可降低變應性鼻炎大鼠血清炎癥因子含量，減少生成IgE，調節T 細胞免疫失衡，其作用機制可能和抑制TLR4/NF-B 信號通路表達有關。