白及基因組DNA分離方法效果比較

張子雄 蔣影 張家春 戚燕強 孫超

摘? ? 要：以白及為試驗材料，采用優化的CTAB法和試劑盒法提取白及葉片的基因組DNA。結果表明：優化的CTAB法提取出的DNA檢測濃度值為252.8～664.8 ng/μL，試劑盒法的檢測濃度值為31.7～52.3 ng/μL。證明優化CTAB法和DNA試劑盒法都能獲得基因組DNA的良好完整性和高純度。

關鍵詞：白及;DNA提取;優化的CTAB;試劑盒法

文章編號：1005-2690（2021）17-0022-02? ? ? ?中國圖書分類號：R282.71? ? ? ?文獻標志碼：B

白及（Bletilla striata （Thunb.）H.G.Reichenbach）是蘭科白及屬的多年生草本植物[1]，主要分布于我國貴州、廣西、云南、湖南省等多數地區[2-4]。基因組DNA承載著植物的基本遺傳物質和遺傳信息，要進行其后續的分子層面的生物學試驗，提取一定數量、高質量的DNA樣品是必不可少的。根據不同植物種的生物特性和基因組DNA的不同，進行提取方法的優化是進行分子標記試驗的第一步也是最為關鍵的一步[5-6]。由于白及的葉片中富含有多糖、多酚等次生代謝產物，不容易去掉雜質，經反復試驗，總結出此試驗方法步驟。

1? ?結果與分析

1.1? ?DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測分析

使用優化的CTAB法提取白及基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，DNA電泳條帶整齊清楚明顯，沒有拖帶，DNA的條帶均高于Marker的最高條帶。使用DNA提取試劑盒法提取結果如圖2，條帶也依然清晰明亮。使用傳統CTAB法如圖3，會發現有些孔中電泳條帶有拖帶現象，有些孔中提取的DNA電泳條帶很弱甚至無條帶。

1.2? ?基因組DNA濃度和純度檢測分析

使用優化的CTAB法提取白及基因組DNA濃度和純度檢測結果見表1。結果中所含有的RNA、蛋白質、酚類物質的雜質、殘留的鹽或小分子雜質較少。DNA檢測濃度值在252.8～664.8，表明與試劑盒法提取相比提取濃度更高。使用DNA提取試劑盒法提取的結果見表2。所提取DNA的結果中所含有的RNA、蛋白質、酚類物質的雜質更少。DNA檢測濃度值在31.7～52.3，表明DNA的提取濃度恰好滿足后續PCR分子試驗的濃度標準要求。

2? ?試驗材料與方法

2.1? ?材料

以種植于貴州省植物園藥用植物試驗基地的白及植株的尖端嫩葉為材料。

2.2? ?方法

2.2.1? ?優化的CTAB法提取基因組DNA

優化的CTAB法試驗步驟如下：①加入液氮，加白及頂端新鮮嫩葉迅速研磨，放入2 mL離心管中，加1.5 mL4 ℃預冷的STE裂解液（NaCl 0.25 mol/L，EDTA（pH值8.0）50 mol/L，Tris-HCl （pH值8.0）0.2 mol/L， β-巰基乙醇1%，2 gpvp）。②離心時間為6 min，轉速為8 000 r/min，棄上層清液;加1.5 mL 4 ℃預冷STE裂解液，充分混勻。離心6 min，轉速8 000 r/min，棄上層清液。③加65 ℃預熱的1 mL的4×CTAB提取緩沖液，65 ℃水浴45 min，其間每隔15 min震蕩1次。④4 ℃離心8 min，轉速11 000 r/min;取800 μL上清液，加到2 mL的離心管中。再加入與之等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）溶液，輕微顛倒混勻3 min。⑤4 ℃中離心8 min，轉速11 000 r/min;抽取600 μL的上清液，加到2 mL離心管中，加入等體的氯仿/異戊醇（24∶1）溶液，顛倒混勻3 min。⑥重復⑤。⑦吸取200 μL的上清液，加入1.5 mL的離心管之中，加入等體積的預冷異丙醇，輕微震蕩，置于-20 ℃沉淀0.5～1 h。⑧4 ℃離心6 min，轉速11 000 r/min，4 ℃預冷70%乙醇清洗兩次，加入90 μL TE緩沖液溶解沉淀，加入10 μL RNaseA酶（10 mg/mL），37 ℃水浴鍋中水浴30 min;放入-20 ℃保存。

2.2.2? ?基因組DNA質量的檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測，參照張子雄等（2017）方法。核酸蛋白分析儀檢測，參照張子雄等（2017）方法。

3? ?討論

劉亭等（2014）是直接進行水浴，但試驗在水浴之前加入STE裂解液進行雜質的清洗，可以更好地進行后續步驟;且試驗進行了兩次氯仿/異戊醇（24∶1）溶液的添加，去除雜質更徹底。周延清等（2005）利用SDS提取液提取的DNA雜質更多，無法去除葉片中的酚類物質氧化成醌類物質和蛋白質結合的產物。在張子雄等（2017）對柱花草DNA提取的基礎上改變了裂解液的使用，針對白及能很好地去除雜質。

DNA試劑盒法所提取的DNA結果純度很高，雜質少。但此方法提取的DNA濃度只是剛好達到后續PCR試驗中DNA模板濃度30 ng/μL的最低標準要求，遠遠低于優化的CTBA法的提取結果。每個處理提取量太少，只適合滿足檢測小劑量試驗使用，不適合大劑量多組次的試驗使用。優化的DNA提取分離方法是在之前學者們的方法上經過反復試驗，針對貴州道地藥材白及這一植物葉片材料加以改進、優化、總結。不僅在很大程度上節省了工作試驗時間，而且濃度、純度均滿足后續大劑量多組次的分子試驗要求，為后續順利地開展分子試驗研究打下基礎。兩種方法各有利弊，也各有其用途，DNA試劑盒法適用于少組數的檢測試驗，優化的CTAB法適用于多組數、大劑量的試驗需求[7-8]。

參考文獻：

[ 1 ] 李偉平，何良艷，丁志山.白及的應用及資源現狀[J].中華中醫藥學刊，2012，30（1）：158.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：人民衛生出版社，2010.

[ 3 ] 任華忠，何毓敏，楊麗.白及化學成分其藥理活性研究進展[J].亞太傳統醫藥，2009，5（2）：134

[ 4 ] 俞林花，聶緒強，潘會君，等.白及多糖對糖尿病潰瘍創面愈合的作用研究[J].中國中藥雜志，2011，36（11）：1487.

[ 5 ] 周延清.DNA分子標記技術在植物研究中的應用[M].北京：化學工業出版社，2005.

[ 6 ] 劉亭，雷諝婷，羅阿東，等.白及DNA提取方法研究[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（12）：119-123.

[ 7 ] Fu L K，Jin J M.China plant red data book：rare and endangered plants （Vol.1）[M].Beijing：Science Press，1992.

[ 8 ] 唐燕瓊，吳紫云，郭建春，等.柱花草DNA提取及ISSR反應體系的正交優化[J].熱帶作物學報，2008（3）：352-357.