多元復合抗性淀粉對高糖高脂模型小鼠代謝調節作用及機制

陳彥君，劉家宏，張 翔，崔敬愛，陳曉平

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

飲食結構和人體健康有著非常緊密的聯系，高血糖、高血脂、結直腸癌等各類由于飲食結構不合理導致的疾病也隨之而來，代謝綜合征的患病率在世界范圍內急劇增加并達到流行水平[1]。抗性淀粉（Resistant starch，RS）作為一種來源廣泛、口感良好的新興食品原料，具有飽腹感強、消化率低、血糖生成指數低等特點，受到廣泛關注[2?3]。RS的性質與溶解性纖維相似，可發揮出膳食纖維的功效，可降低由糖尿病和心血管等高脂飲食相關疾病的風險，對高血脂癥、高血壓和糖尿病患者具有非常積極的作用[4?6]。研究證實，RS 不僅可以降低總膽固醇、甘油三酯等的含量，對腸道微生物菌群及腸道上皮細胞更具有調節和保護作用[7?8]。短鏈脂肪酸是厭氧微生物在腸道內發酵分解抗消化多糖、蛋白質、多肽等物質生成的代謝產物[9]。Akbaryan 等[10]發現，RS 進入大腸后能夠促進有益微生物代謝，使腸道中有益微生物發酵RS 與腸道代謝產物被吸收利用，從而有效降低2 型糖尿病、結直腸癌的風險，可預防和緩解一些由于不健康飲食所引起的慢性疾病[11]。白建江等[12]的研究結果表明，高抗性淀粉稻米可較明顯地降低2 型糖尿病大鼠血糖的作用和糖耐量的提高，有明顯改善2 型糖尿病大鼠脂代謝紊亂和降脂的作用。目前，國內外對RS的研究多為香蕉、鷹嘴豆、蓮子等單一品種，對于復合性抗性淀粉研究較少，本文將綠豆、苦蕎、藜麥混合后制成復合RS。

本文探究了復合RS 對高糖高脂小鼠體質量、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein，HDL-C）、肝糖原及腸道內容物短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）等指標的影響，為多元復合RS 作為高血糖癥、高血脂癥人群的膳食主料提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級雄性C57BL/6 小鼠（SCXK（京）2019-0008） 60 只，4 周齡，體質量在18～22 g 之間，由吉林農業大學實驗動物中心提供，喂養期間，動物室內設置12 h 光暗交替循環，小鼠可自由獲取飲食和隨意飲水，維持動物室內溫度在21～25 ℃之間，濕度50%～70%，飼養于吉林農業大學實驗動物中心SPF實驗室[13]；高糖高脂飼料配方：基礎飼料52.5%、豬油10%、膽固醇2%、蔗糖30%、蛋黃粉5%、膽酸鹽0.5%[14]；二甲雙胍 上海施貴寶藥廠；氯化鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；甘油 范德（北京）生物科技有限責任公司；正己酸、硫酸 北京化工廠；無水乙醚 天津市北聯精細化學品開發有限公司；三諾安穩血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司；總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白試劑盒、肝糖原試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司。

三諾安穩血糖儀 三諾生物傳感股份有限公司；H01-B 電子天平 廈門雄發儀器儀表有限公司；GRM-1 磨粉機 天津市秦斯特儀器有限公司；TL80-2高速離心機 江蘇天力醫療器械有限公司；GC-2010型氣相色譜 日本島津公司；MK-X 潔凈動物培養箱 上海堃擇實業有限公司；Systec V-75 立式壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫療器械股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多元復合RS 制備 綠豆、苦蕎、藜麥，市售。磨粉處理，過篩100 目，綠豆粉、苦蕎粉和藜麥粉以1:1:1 比例充分混勻[15]。壓熱方法制取抗性淀粉，121 ℃下壓熱反應30 min 冷卻至室溫后，加入0.2%α-淀粉酶，在70 ℃恒溫水浴鍋中水解1 h，冷卻至室溫。添加0.4%普魯蘭酶，恒溫60 ℃下酶解12 h 后取出，100 ℃滅菌10 min，冷卻至室溫。在4 ℃冰箱中冷藏24 h，60 ℃烘干至恒重粉碎過100 目篩，制得多元復合RS，得率為27.3%。

1.2.2 高糖高脂模型小鼠的建立及分組 將60 只小鼠隨機成6 組，每組10 只，分為正常對照組、模型對照組、RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組和陽性對照組。在基礎飼料喂養下使小鼠適應實驗室環境1 周后，模型對照組、RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組、陽性對照組小鼠進行自由飲食，進入8 周高糖高脂小鼠模型實驗。8 周后，模型對照組、RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組和陽性對照組小鼠經隔夜禁食處理后尾尖取血測空腹血糖，空腹血糖在12.0 mol/L 以上的小鼠可宣布高糖高脂小鼠模型成功[13]。各組小鼠連續灌胃4 周，各組灌胃試劑及劑量如表1。

表1 試驗動物分組設計Table 1 Experimental design and animal grouping

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 小鼠處理 每周拾取新鮮的小鼠糞便，記錄每只小鼠的體質量，尾處尖取血，使用血糖儀測定空腹血糖數值[17?18]。處死前12 h 小鼠禁食不禁水，解剖前進行稱重、測血糖，摘取小鼠眼珠進行采血，然后將血樣儲存在4 ℃下干凈的離心管中進行3000 r/min、10 min 離心處理，將小鼠腹腔和胸腔打開，將肝臟和結腸腸道內容物保存在甘油中，儲存在?20 ℃冰箱中，用于測量肝糖原含量和SCFAs[19?21]。檢測小鼠血清內TC、TG 和HDL-C 糖脂代謝指標，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作[22]。

1.2.3.2 短鏈脂肪酸（SCFAs） 取0.2 g 腸道內容物，加入0.2 mL 正己酸。并向其中繼續注入1.6 mL蒸餾水，搖勻，然后添加0.4 mL 50%硫酸和2 mL 無水乙醚。然后將這一些取得液體在振蕩器上于120～160 r/min 混合30 min。混合后，加入無水氯化鈣，然后以3000 r/min的速率離心5 min。最后，取上清液用于氣相檢測。SCFA的測定使用外標方法繪制乙酸、丙酸和丁酸的標準曲線。氫火焰探測器（FID）；色譜柱為DB-FFAP；載氣為N2，分流比為10:1，流速為2 mL/min；爐溫240 ℃，進樣量為2 μL；初始溫度在120 ℃下持續5 min，然后以10 ℃/min的溫度升至250 ℃并保持1 min的加熱程序[23]。

1.3 數據處理

運用SPSS（21）統計軟件進行數據分析。所有數據均表示為平均值±標準差（），各組小鼠之間的比較采用單因素卡方檢驗，P<0.05 為差異性顯著，P<0.01 為差異性極顯著。

2 結果與分析

2.1 多元復合RS 對小鼠體質量的影響

多元復合RS 對小鼠體質量的影響結果見表2。如表2 所示，正常對照組小鼠體質量漲幅均在正常范圍內變化，在4 周小鼠高糖高脂模飲食實驗后，模型對照組小鼠與正常對照組體質量有極顯著差異（P<0.01）。4 周多元復合RS 干預后，RS 低、RS中、RS 高劑量組體質量與模型對照組相比均有一定降低，RS 高劑量組與模型對照組小鼠的體質量相比體質量下降9.24%，RS 高劑量組小鼠的體質量與正常對照組無顯著性差異（P>0.05）。結果表明，RS 能有效減緩高脂飲食誘導的小鼠體重的快速上升，且其效果與劑量存在依賴關系。

表2 多元復合RS 對小鼠體質量的影響(g)Table 2 Effect of multiple compound RS on the body weight of mice(g)

2.2 多元復合RS 對小鼠血清中血糖含量的影響

多元復合RS 對小鼠血清中血糖含量的影響結果見表3。如表3 所示，72 h 后檢測血糖濃度，各干預組小鼠血糖值均高于12.0 mmol/L 以上，模型對照組與正常對照組相比差異極顯著（P<0.01），高血糖小鼠造模成功。經4 周灌胃后，模型對照組血糖濃度呈持續增高趨勢；RS 高劑量組與模型對照組相比小鼠血糖濃度極顯著降低（P<0.01），下降了59.71%，且RS 高劑量組與陽性對照組血糖濃度無顯著差異（P>0.05），說明多元復合RS 可有效控制血糖，RS 高劑量的多元復合RS 降血糖功能效果更佳。

表3 多元復合RS 對小鼠血清中血糖含量的影響(mmol/L)Table 3 Effect of multi compound RS on blood glucose of mice(mmol/L)

2.3 多元復合RS 對小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C含量的影響

多元復合RS 對小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C含量的影響結果見表4。如表4 所示，在為期4 周的實驗過程中，模型對照組小鼠血清TC 和TG 與正常對照組相比有極顯著的升高（P<0.01），HDL-C 極顯著減少（P<0.01）。RS 高劑量組的TC、TG 與模型對照組相比均有極顯著減少（P<0.01），分別下降31.22%、36.72%，RS 中劑量組、RS 高劑量組的效果與陽性對照組相似無顯著差異（P>0.05）。由實驗結果可知，多元復合RS 與陽性藥物二甲雙胍兩者都能有效的減弱高糖高脂小鼠血清TC 和TG 水平。RS 高劑量組與模型對照組相比，RS處理能顯著升高小鼠血清中HDL-C 水平（P<0.01），上升58.93%。實驗表明，多元復合RS 可以有效控制小鼠血清中TC 和TG 含量，可提升小鼠血清中的HDL 水平。

表4 多元復合RS 對小鼠血清中 TC、TG 和HDL-C 含量的影響Table 4 Effect of multi-component RS on the serum contents of TG,TC,and HDL-C in mouse

2.4 多元復合RS 對小鼠肝糖原含量的影響

多元復合RS 對小鼠肝糖原含量的影響結果見表5。

表5 多元復合RS 對小鼠肝糖原含量的影響Table 5 Effect of multiple compound RS on hepatic glycogen in mice

體內的肝糖原代謝調節血糖水平，飯后或糖分攝入后為了降低血糖水平，攝入過多的葡萄糖可進入肝臟以肝糖原的狀態儲存起來；當體內血糖不足時，肝糖原經磷酸化酶催化代謝產生葡萄糖，進入血液中維持血糖穩定，保證機體內環境穩態。如表5 所示，模型對照組與正常對照組相比肝糖原含量極顯著降低（P<0.01），RS 處理組小鼠肝糖原相比于模型對照組均有升高，其中RS 高劑量組與模型對照組相比肝糖原含量極顯著升高207.86%（P<0.01）。經4 周的多元復合RS 誘導后，RS 高劑量組的肝糖原含量與陽性對照組無顯著差異（P>0.05）。說明多元復合RS 能有效提高小鼠體內肝糖原濃度，且其效果與劑量存在依賴關系。

2.5 多元復合RS 對小鼠結腸SCFAs的影響

2.5.1 多元復合RS 對結腸中乙酸的影響 多元復合RS 對結腸中乙酸的影響結果見圖1。

圖1 多元復合RS 對結腸中乙酸的影響Fig.1 The effect of multiple compound RS on acetic acid in colon

如圖1 所示，在4 周干預中，多元復合RS 灌胃小鼠結腸中乙酸含量顯著高于正常對照組、模型對照組、陽性對照組小鼠結腸中乙酸濃度，模型對照組與RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組乙酸濃度增長較為明顯。干預灌胃初期，各組增長變化較為緩慢，干預4 周時，RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組結腸中乙酸的含量與模型對照組相比均有顯著升高，RS 高劑量組的小鼠結腸中乙酸濃度高于其他各組，說明一定劑量的多元復合RS 可有效促進小鼠腸道厭氧菌群代謝產生乙酸。

2.5.2 多元復合RS 對結腸中丙酸的影響 多元復合RS 對小鼠結腸中丙酸含量的影響結果見圖2。

圖2 多元復合RS 對小鼠結腸中丙酸含量的影響Fig.2 Effect of multiple compound RS on propionic acid contents in colon of mice

如圖2 所示，隨著干預時間增加，多元復合RS 灌胃的小鼠結腸中丙酸濃度均有不同程度的上升,多元復合RS 灌胃的小鼠結腸中丙酸濃度明顯超過了正常對照組、模型對照組、陽性對照組小鼠結腸中丙酸濃度。在2 周干預后RS 高劑量組與RS 中劑量組小鼠結腸中的丙酸濃度明顯高于RS 低劑量組，在4 周時RS 高劑量組與RS 低劑量組、RS 中劑量組相比丙酸含量顯著升高。說明一定劑量的多元復合RS 可有效促進小鼠腸道代謝產生丙酸。

2.5.3 多元復合RS 對結腸中丁酸的影響 多元復合RS 對結腸中丁酸的影響結果見圖3。

圖3 多元復合RS 對小鼠結腸中丁酸含量的影響Fig.3 Effect of multiple compound RS on butyric acid contents in colon of mice

如圖3 所示，隨著干預時間增加，多元復合RS 灌胃的小鼠結腸中丁酸濃度均有不同程度的上升,多元復合RS 灌胃的小鼠結腸中丙丁酸濃度明顯超過了正常對照組、模型對照組、陽性對照組小鼠結腸中丁酸濃度。各組多元復合RS 小鼠在干預后，各組中丁酸濃度以較快的速度增長，在干預2 周后RS 高劑量組與RS 中劑量組小鼠結腸中丁酸濃度明顯高于RS 低劑量組，在4 周時RS 低劑量組、RS 中劑量組、RS 高劑量組的丁酸濃度與模型對照組的丁酸濃度差異顯著。一定劑量的多元復合RS 可有效促進小鼠腸道代謝產生丁酸。

3 討論與結論

大量研究表明，RS 對體質量和血糖水平具有調節作用，因其具有抗消化的特點，RS 可明顯降低空腹和餐后血糖，增加胰島素敏感性，起到控制干預糖尿病病情的作用[24]。試驗結果表明，連續灌胃4 周后多元復合RS 能有效控制由于高糖高脂飲食引起的小鼠的體重異常，一定劑量的多元復合RS 具有與陽性藥物二甲雙胍相當的降低高糖高脂模型小鼠餐后血糖的作用，可有效調節血糖值。有研究表明RS 具有調節血脂的作用[25]，多元復合RS 能降低小鼠血清中 TC、TG的含量，增加 HDL的含量，有效改善脂質代謝異常高糖高脂小鼠血脂水平，對脂代謝紊亂進行糾正，對高糖高脂小鼠具有一定的調節血脂作用。2 型糖尿病患者肝組織的肝葡萄糖輸出量異常和胰島素抵制作用，RS 可以在肝糖原修復中發揮作用，人體機體對于胰島素含量的敏感程度通過肝臟組織糖原含量的變化可有效反映[26?27]。經多元復合RS 灌胃的小鼠肝糖原含量均有明顯增加，推測多元復合RS 能有效促進肝糖原的合成或降低肝糖原的分解速率，有效地改善肝功能。RS 促進乙酸、丙酸、丁酸濃度升高可調節腸道內酸堿度降低，積極促進有益菌的生成，減少腸道腐敗菌的數量，腸道菌群達到平衡的狀態，并且對維持機體生命活動的能量輸送和調控具有重要作用，產生的SCFAs 能在短期內降低肝葡萄糖的產量從而減少輸出[28?29]。楊玥熹等[30]、賈彥等[31]的研究表明，RS 可促進乙酸、丙酸、丁酸的合成，提高結腸中SCFAs的含量。多元復合RS 由三種原料谷物混合提取而成，存在多種膳食纖維與微量元素，三種原料之間是否有協同促進作用及其作用機理有待進一步深入研究。

綜上所述，以綠豆、苦蕎、藜麥三種谷物為原料制得的多元復合RS，能有效地控制高糖高脂模型小鼠的體質量增長，有效調節小鼠血糖水平，促進肝糖原合成；多元復合RS 可調節小鼠血脂濃度，降低小鼠血清中 TC、TG的含量，增加 HDL的含量，有效改善脂質代謝紊亂，預防高血脂癥；多元復合RS 可積極促進腸道內菌群發酵產生SCFAs，有助于腸道中SCFAs的代謝，促進小鼠腸道中發酵產生的乙酸、丙酸、丁酸含量，調節腸道菌群。對研究開發高糖高脂不良飲食習慣人群相關功能保健食品的適用性提供了參考依據。