沉默NRF2基因表達及鴉膽子苦醇均可抑制人膽管癌RBE細胞增殖

潘若谷，李可為

膽管癌是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱襲、進展迅速、惡性程度高的特點。據(jù)美國癌癥協(xié)會的統(tǒng)計，膽管癌患者的5年生存率只有8%～10%。大部分經(jīng)臨床診斷的膽管癌患者均已處于中晚期，已失去了根治性手術切除的機會[1]，并且膽管癌還具有明顯的耐藥特征[2]。因此，探究膽管癌快速增殖背后的具體機制以及尋找潛在的治療靶點具有重要的科研和臨床意義。

NRF2是調(diào)控細胞氧化應激反應的重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與機體的生理和病理過程[3]。眾多的研究指出，NRF2在包括肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌和宮頸癌等眾多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和增殖等過程中都發(fā)揮著十分重要的作用[4-8]。然而，縱觀近10年的研究，鮮有關于NRF2在膽管癌增殖中作用的相關報道。本研究旨在檢測NRF2在正常人體膽道組織和膽管癌組織中NRF2表達水平的差異，并通過siRNA沉默NRF2在人膽管癌細胞株RBE中的表達水平，探討NRF2表達對膽管癌細胞快速增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）檢索正常人膽道組織和膽管癌組織中NRF2 mRNA的表達水平。

1.2 細胞、試劑及儀器

人膽管癌細胞株RBE由上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院膽胰外科保存并傳代，正常膽管上皮H69細胞由上海交通大學基礎醫(yī)學院生化系保存并傳代。LipofectAMINE 2000和TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，tbGREEN實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自上海源培生物科技股份有限公司；RIPA裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，CCK-8檢測試劑盒、DCFH-DA細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測探針試劑盒和鴉膽子苦醇試劑購自美國MCE公司，快速吉姆薩染色試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗人NRF2和β-actin多克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG購自美國Sigma公司。

1.3 實時熒光定量PCR檢測NRF2 mRNA的表達水平

分別將RBE細胞和正常膽管上皮H69細胞接種于直徑為10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞生長至60%～70%的融合度時收集細胞，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA；隨后用tbGREEN實時熒光定量PCR試劑檢測各組細胞中NRF2 mRNA的表達水平；反應體積及PCR擴增流程按試劑盒說明書中提供的流程進行，分別以內(nèi)照參β-actin及GAPDH基因的Ct值，計算目的基因NRF2 mRNA的相對表達量。NRF2基因上游引物序列為5’-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3’，下游引物序列為5’-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-GG AGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；β-actin基因上游引物序列為5’-GGCATTC ACGAGACCACCTAC-3’，下游引物序列為5’-CGACATGACGTTGTTGGCATAC-3’。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測NRF2蛋白的表達水平

分別將RBE細胞和正常膽管上皮H69細胞接種于直徑為10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞生長至60%～70%融合度時收集細胞，加入RIPA裂解液，在裂解液中充分裂解細胞后提取細胞總蛋白，并通過BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行檢測。2組細胞各取30 μg蛋白樣品進行上樣，用分離膠濃度為10%的SDS-PAGE分離蛋白，隨后將分離后的蛋白通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜于含5%脫脂牛奶的封閉液中封閉1 h后，加入一抗[兔抗人NRF2及β-actin多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）] 4 ℃孵育過夜，次日室溫條件下加入二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）]孵育1 h后，于凝膠成像儀下曝光顯影。

1.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

RBE細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至約70%融合度時，采用LipofectAMINE 2000將特異性針對NRF2基因的2條siRNA（siNRF2-1和siNRF2-2）及陰性對照（negative control，NC）siRNA（siNC）轉(zhuǎn)入RBE細胞，轉(zhuǎn)染流程按試劑盒相關說明。隨后分別采用實時熒光定量PCR（實驗流程同1.3節(jié)）和蛋白質(zhì)印跡法（實驗流程同1.4節(jié)）檢測siRNA的沉默效率。siNRF2-1正義鏈序列為5’-AAGUUUUUUCUGUUUUUCCAG-3’，反義鏈序列為5’-GGAAAAACAGAAAAAACUU GA-3’；siNRF2-2正義鏈序列為5’-UCAUU UUCAAUAUUAAGACAC-3’，反義鏈序列為5’-GUCUUAAUAUUGAAAAUGACA-3’；siNC

正義鏈序列為5’-UCAACUUCUGUCAGUUUG GCU-3’，反義鏈序列為5’-CCAAACUGACAG AAGUUGACA-3’。

1.6 DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS的含量

取對數(shù)生長期的siNRF2-1組、siNRF2-2組和siNC組RBE細胞接種于96孔板中，待細胞生長至合適密度后，采用DCFH-DA試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS的含量，實驗流程按照試劑盒的操作說明進行。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的siNRF2-1組、siNRF2-2組和siNC組RBE細胞，以2 000個/孔的密度接種于96孔板中。分別于24、48、72和96 h時，加入CCK-8試劑，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm處檢測各組細胞的D值，并計算相對生存活力表示細胞的增殖情況，具體檢測流程參閱CCK-8試劑盒流程說明。

1.8 細胞克隆形成實驗

收集生長至對數(shù)生長期的siNRF2-1組、siNRF2-2組和siNC組RBE細胞，以500個/孔的密度接種至96孔板中。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，7 d后更換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)7 d。14 d后，除去所有培養(yǎng)液，采用快速吉姆薩染色試劑盒進行克隆染色，具體流程按試劑盒操作說明。記錄肉眼可見的克隆數(shù)（獨立不連續(xù)的肉眼可見的克隆球）并進行統(tǒng)計分析。

1.9 鴉膽子苦醇對RBE細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的RBE細胞，以4×103個/孔的密度接種于96孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分為4組，siNRF2-1組、siNRF2-2組、siNC組和siNC＋鴉膽子苦醇組；siNC組RBE細胞培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，加入鴉膽子苦醇（100 μL/孔）。分別于24、48、72和96 h時，采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的增殖情況，實驗流程同1.7節(jié)。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism version 8.0統(tǒng)計學軟件對所有的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有實驗均獨立重復3次，計量資料以表示。多組間比較采用多因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NRF2在膽管癌中高表達

通過在UALCAN數(shù)據(jù)庫中檢索并分析比對正常膽道組織（9例）和膽管癌組織（36例）中NRF2的表達情況。結果（圖1A）顯示，膽管癌組織組中NRF2的表達水平相較正常膽道組織組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

分別采用實時熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測正常膽管上皮H69細胞和膽管癌RBE細胞中NRF2的表達情況。結果（圖1B和圖1C）顯示，H69細胞中NRF2 mRNA和蛋白的表達水平均低于RBE細胞（P均＜0.01）。這一結果與數(shù)據(jù)庫中檢索獲得的結果一致，提示膽管癌細胞確實具有高表達NRF2的特點。

2.2 采用siRNA沉默RBE細胞中NRF2的表達水平及對RBE細胞中ROS含量的影響

為了進一步探究NRF2對膽管癌的增殖能力是否具有重要的影響，本研究采用siRNA沉默RBE細胞中NRF2的表達水平。實時熒光定量PCR（圖2A）和蛋白質(zhì)印跡法（圖2B）檢測結果顯示，siNRF2-1和siNRF2-2組RBE細胞中NRF2 mRNA和蛋白的表達水平均明顯下調(diào)（P均＜0.05）。這一結果提示，本研究中設計的2條siNRF2-1和siNRF2-2均能夠有效沉默RBE細胞內(nèi)NRF2基因的表達水平。

由于NRF2是氧化應激時參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和維持細胞內(nèi)ROS水平穩(wěn)定的重要轉(zhuǎn)錄因子[9]，因此細胞內(nèi)的ROS水平會伴隨NRF2表達水平的改變而發(fā)生改變。DCFH-DA法檢測結果（圖2C）顯示，當敲低NRF2基因的表達水平后，2組RBE細胞內(nèi)ROS水平均出現(xiàn)了明顯回升（P＜0.05和P＜0.01）。這一結果進一步說明，有效敲低RBE細胞內(nèi)NRF2的表達水平后能明顯提高細胞內(nèi)ROS的水平。

Fig.1 High expression of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) was observed in cholangiocarcinoma.A: The expression level of NRF2 mRNA in bile duct and cholangiocarcinoma was analyzed by UALCAN database.B: The expression level of NRF2 mRNA in normal bile duct epithelial H69 cells and cholangiocarcinoma RBE cells was detected by real-time fluorescent quantitative PCR (n=3).C: The expression levels of NRF2 protein in H69 cells and RBE cells was detected by Western blotting.*P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).圖1 NRF2在膽管癌中高表達

2.3 NRF2是膽管癌細胞增殖的重要調(diào)節(jié)因素

在明確siRNA能夠有效敲減RBE細胞內(nèi)NRF2基因的表達水平后，本研究進一步對NRF2對膽管癌細胞的增殖能力是否產(chǎn)生重要的影響展開研究。CCK-8法檢測結果（圖3A）顯示，伴隨NRF2表達水平的下調(diào)（siNRF2-1和siNRF2-2組RBE細胞），膽管癌細胞的增殖能力出現(xiàn)了明顯下降（P均＜0.01）。

進一步通過平板克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)，NRF2敲低的膽管癌細胞（siNRF2-1和siNRF2-2組RBE細胞）相較于對照組RBE細胞，其形成的克隆數(shù)量明顯減少（圖3B）。這一結果提示，沉默NRF2表達能抑制RBE細胞的增殖能力，NRF2確實對膽管癌的增殖產(chǎn)生了重要的影響。

2.4 鴉膽子苦醇能夠有效抑制膽管癌細胞的增殖

鴉膽子苦醇是一類苦木內(nèi)酯類化合物，能夠通過靶向抑制NRF2的活性而發(fā)揮抗癌作用[12]。已有研究報道，鴉膽子苦醇能夠抑制部分腫瘤的增殖[13]，但目前尚未有該藥物應用于膽管癌治療細胞的報道。因此，本研究進一步旨在對該藥物是否基于抑制NRF2的表達從而發(fā)揮治療膽管癌的效果展開探討。

CCK-8法檢測結果（圖4A）顯示，相較于siNC組，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細胞的增殖能力被明顯抑制（P＜0.01）；但與siNRF2-1組和siNRF2-2組細胞相比，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細胞的活性差異無統(tǒng)計學意義；這一結果提示，鴉膽子苦醇能抑制RBE細胞的增殖。

Fig.2 Effect of silencing nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) gene in cholangiocarcinoma RBE cells by siRNA and the effect on reactive oxygen species (ROS) content in RBE cells.A: The expression level of NRF2 mRNA in RBE cells transfected with siRNA targeting NRF2 gene (siNRF2-1 and siNRF2-2) was detected by real-time quantitative PCR.B: The expression level of NRF2 protein in RBE cells transfected with siNRF2-1 and siNRF2-2 was detected by Western blotting.C: The ROS level in RBE cells transfected with siNRF2-1 and siNRF2-2 was detected by DC-FHDA method.RBE cells transfected with negative control siRNA (siNC) were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).圖2 siRNA有效沉默膽管癌RBE細胞中NRF2基因的表達水平及對RBE細胞中ROS含量的影響

Fig.3 The proliferation of RBE cells with silencing of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) gene was detected by CCK-8 (A) and plate clone formation experiment (B),respectively.siNRF2-1 and siNRF2-2:RBE cells were transfected with siRNA targeting NRF2 gene (siNRF2-1 and siNRF2-2);RBE cells transfected with negative control siRNA (siNC) were taken as the control.**P＜0.01 (n=3).圖3 分別采用CCK-8法（A）和平板克隆形成實驗（B）檢測沉默NRF2基因表達對膽管癌RBE細胞增殖能力的影響

實時熒光定量PCR法檢測結果（圖4B）顯示，相較于siNC組，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細胞中NRF2 mRNA的表達水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。

進一步采用DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS的水平，結果（圖4C）顯示，相較于siNC組，siNC＋鴉膽子苦醇組RBE細胞中ROS的含量明顯提高（P＜0.01）。這一結果提示，鴉膽子苦醇能有效提高RBE細胞內(nèi)的ROS含量。綜合上述結果，本研究認為鴉膽子苦醇能夠通過抑制膽管癌細胞RBE內(nèi)NRF2的表達水平從而發(fā)揮抑制膽管癌細胞增殖的效果。

Fig.4 Effects of brusatol on proliferation and reactive oxygen species (ROS) content of cholangiocarcinoma RBE cells.A: The proliferation of RBE cells was detected by CCK-8 method.B: The expression level of nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) mRNA in RBE cells was detected by realtime fluorescent quantitative PCR.C: The restoration of cellular ROS was detected by DC-FHDA assay.siNC: RBE cells were transfected with negative control siRNA;siNRF2-1 and siNRF2-2: RBE cells were transfected with siRNA targeting NRF2 gene;siNC+brusatol: RBE cells were transfected with siNC combined with brusatol.**P＜0.01 (n=3).圖4 鴉膽子苦醇對膽管癌RBE細胞增殖及ROS含量的影響

3 討論

膽管癌是一類源自膽管上皮的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱襲、惡性程度高、進展迅速的特點[1,12]。有研究顯示，膽管癌的治療主要包括手術治療和化學藥物治療[13]，由于被臨床診斷的患者大多處于中晚期和晚期且常伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移從而失去了手術切除的機會，因此化學藥物治療成為了眾多膽管癌患者的重要治療方式之一[14]。然而，由于膽管癌的異質(zhì)性極強，因此對以吉西他濱為一線治療藥物的化療方案表現(xiàn)出了人群的耐藥效應[15]。因此，闡明膽管癌增殖的重要調(diào)控因素并探索開發(fā)新的治療策略對攻克膽管癌具有很重要的意義。

NRF2是一種氧化應激條件下起關鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，能夠在受到ROS刺激時啟動眾多抗氧化反應元件（antioxidative response elements，ARE）的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抵抗氧化應激的重要作用[16]。通常情況下，NRF2通過與KEAP1形成復合體并降解的形式而處于低表達狀態(tài)[9]。既往的研究大量文獻報道提示，包括肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌在內(nèi)的眾多類型腫瘤中都檢測到了NRF2表達水平增高或被異常激活[3,17-19]，然而膽管癌中NRF2的表達是否發(fā)生改變卻鮮有報道。本研究中發(fā)現(xiàn)，膽管癌中NRF2的表達水平與其他腫瘤出現(xiàn)了類似的升高現(xiàn)象，這意味著NRF2可能也在膽管癌中發(fā)揮著重要的作用。由于NRF2是細胞控制氧化還原平衡的重要環(huán)節(jié)，因此當腫瘤細胞中出現(xiàn)NRF2的表達水平增高時也通常會伴有細胞內(nèi)ROS水平的顯著降低。ROS作為一類性質(zhì)極其活潑同時又廣泛參與細胞生命活動的小分子物質(zhì)同樣會對相關基因的表達產(chǎn)生重要的影響[8,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在膽管癌RBE細胞內(nèi)NRF2表達水平高表達的情況下，其細胞內(nèi)ROS的含量明顯減低，這與之前本課題組的推測是相符的。同時，大量的研究指出ROS能夠?qū)Ω伟⑽赴┖褪彻馨┑葠盒阅[瘤的增殖產(chǎn)生抑制作用，由此推測降低細胞內(nèi)ROS水平可能也對膽管癌細胞的增殖產(chǎn)生了一定的促進作用，由于本研究著眼于鴉膽子苦醇與NRF2之間的相互作用是否能夠改善膽管癌的進展，因此并未對下降的細胞內(nèi)ROS水平是否對膽管癌的增殖產(chǎn)生了影響進行探索，相關研究會在未來進一步予以完善。

鴉膽子苦醇是近年來新被發(fā)現(xiàn)的一種抗癌藥物，因其能夠靶向NRF2從而發(fā)揮抗腫瘤生長的作用[21]。ZHOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠有效抑制胰腺癌的進展、PARK等[22]則發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠強力抑制結腸癌的進展。本研究中發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇同樣能夠通過靶向抑制NRF2的表達從而抑制膽管癌的增殖并有效提高了膽管癌細胞內(nèi)的ROS水平，具有作為治療膽管癌的新臨床治療方案的可能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)膽管癌具有高表達NRF2的特點并且NRF2的高表達是膽管癌強增殖能力的重要原因。鴉膽子苦醇能夠通過抑制膽管癌細胞內(nèi)NRF2的表達從而發(fā)揮抑制膽管癌增殖的作用，具有應用于臨床治療的潛在可能。