一株鼠李糖乳桿菌培養條件的優化

余萍，張春宇，矯艷平，閔祥博，趙迪，李麗娜

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，沈陽110000）

0 引言

益生菌是一類有益于宿主健康的活性微生物，具有改善宿主腸道的微生態平衡、增強免疫力及緩解乳糖不耐受等生理功能[1-3]。被廣泛應用的益生菌有乳桿菌、腸球菌和雙歧桿菌等[4]。鼠李糖乳桿菌是近年來研究和應用最為廣泛的益生菌，屬異型發酵的無芽孢短桿菌，在顯微鏡下觀察到的鼠李糖乳桿菌常以單鏈狀或成鏈狀存在，具有調節機體免疫、改善脂質代謝等功能[5-9]。

乳酸菌培養基中除需碳源、氮源、維生素及礦物質等營養元素外，還需加入具有促生長作用的物質，即促生長因子。為達到鼠李糖乳桿菌HCS01-003的增殖培養，本研究不僅優化了培養條件，還篩選了優化培養基中的促生長因子，包括低聚異麥芽糖、水蘇糖、低聚半乳糖及維生素B2、維生素B5、維生素B12。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

鼠李糖乳桿菌HCS01-003，篩選自6個月大順產健康嬰兒糞便，漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司提供。

1.1.2 培養基

基礎培養基：蛋白胨8.0 g/L、葡萄糖25.0 g/L、酵母浸出物3.0 g/L、乙酸鈉6.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、吐溫80 0.5 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、余量為純化水，pH值6.20，按照配方比例稱量各組分、混合，加熱溶解，用1 mol/L食品級NaOH溶液調培養基pH值至6.20，115℃下滅菌30 min。

優化培養基：蛋白胨14.0 g/L、葡萄糖30.0 g/L、酵母浸出物6.0 g/L、乙酸鈉3.0 g/L、硫酸鎂0.10 g/L、吐溫80 0.5 g/L、低聚異麥芽糖1 g/L、水蘇糖1.5 g/L、低聚半乳糖2 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、余量為無菌水，pH值6.80；按照配方比例稱量各組分，混合，加熱溶解，用1 mol/L食品級NaOH溶液調培養基pH值至6.80，115℃下滅菌30 min。

1.1.3 促生長因子

低聚異麥芽糖，保齡寶生物股份有限公司；低聚半乳糖，量子高科（中國）生物股份有限公司；水蘇糖，承德京天食品科技有限公司；維生素B2，湖北廣濟藥業股份有限公司；維生素B5，新發藥業有限公司；維生素B12，寧夏金維制藥股份有限公司。

1.1.4 實驗儀器設備

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHP-360/420電熱恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器廠；721型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；三目系列生物顯微鏡，江西江鳳光學儀器有限公司；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種保存

挑取單菌落，接種于5 mL基礎培養基中，37℃靜置培養20 h后，5%接種量轉接于100 mL基礎培養基中，37℃靜置培養16 h。將菌懸液離心后取菌泥，以10∶1的比例加入基礎培養基和甘油混合液（基礎培養基∶50%甘油=2∶3），分裝于凍存管中，-80℃冷凍保存。

1.2.2 菌株生長曲線的測定

將凍存管保存的菌種轉接到10 mL基礎培養基中，37℃靜置培養17 h，獲得菌懸液。以5%的接種量轉接50 mL基礎培養基中，培養0～24 h，每小時取出一瓶測定菌懸液的OD值和pH值，繪制生長曲線。

1.2.3 菌株培養條件的優化

（1）菌種復蘇。將凍存管放入37℃水浴鍋內進行菌種復蘇，15～30 s，至凍存管內液體全部融化。

（2）一級培養。將凍存管內的菌體轉接到10 mL基礎培養基中，一定溫度下培養16 h，獲得菌懸液。

（3）二級培養。將一級培養的菌懸液轉接到100 mL基礎培養基中，上述相同溫度培養16 h，測定菌懸液的pH值、吸光度和收率，考察培養溫度、培養基初始pH值、接種量和需氧型對菌體生長的影響。

（4）三級培養。在較優的培養溫度、初始pH值和需氧型和接種量條件下，將二級培養的菌懸液接種到300 mL優化培養基中，靜置培養16 h，測定菌懸液的收率和活菌數，驗證培養條件。考察因素如表1所示。

表1 培養條件因素水平

1.2.4 優化培養基促生長因子的篩選

（1）單因素篩選。向優化培養基中分別添加1.0 g/L的低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖、維生素B2、維生素B5、維生素B12，115℃滅菌30 min。采用相同的培養條件分別進行三級發酵培養鼠李糖乳桿菌，培養結束后，取菌懸液采用平板計數法檢測活菌數。

（2）促生長因子添加量篩選實驗。將單因素實驗篩選的活菌數較高的促生長因子分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的質量濃度添加到優化培養基中，115℃滅菌30 min。采用相同的培養條件分別進行三級發酵培養鼠李糖乳桿菌，培養結束后，取菌懸液采用平板計數法檢測活菌數，考察促生長因子添加量對菌體生長的影響。

（3）正交實驗。設計正交實驗，將篩選出的促生長因子按照不同的添加量混合添加到基礎培養基中，115℃滅菌30 min，采用相同的培養方法分別培養鼠李糖乳桿菌，培養結束后，取菌懸液采用平板計數法檢測活菌數，考察作用較強的促生長因子復合添加對菌種培養的促生長作用。

2 結果

2.1 菌株生長曲線測定結果

如圖1所示，培養基pH值隨著鼠李糖乳桿菌的生長逐漸降低，是由于菌體在其生長代謝過程中產生了大量的乳酸[10]。菌體培養時間越長，培養基中積累的乳酸越多，導致菌體周圍環境pH值越低，從而干擾菌體正常代謝，抑制其生長繁殖[11-12]。OD值結果發現0～1 h，鼠李糖乳桿菌細胞的分裂繁殖及生長緩慢，處于延滯期；1～16 h菌體生長速率最快，代時最短，進入生長對數期；17～24 h，隨著營養物質的消耗，乳酸含量升高，環境pH值下降，OD值上升趨勢逐漸平緩，說明此時為菌體生長的穩定期。根據鼠李糖乳桿菌HCS01-003菌株生長規律及生產要求等因素，確定自然發酵培養時間定為（16±0.5）h。

圖1 鼠李糖乳桿菌HCS01-003二級培養生長曲線

2.2 菌株培養條件優化結果

2.2.1 培養溫度對菌體生長的影響

固定接種量為4%，初始pH值為6.60，靜置培養，分別考察不同培養溫度33、35、37、39、41℃條件下菌體吸光度和收率。每個條件重復3次實驗，取平均值。培養溫度直接對細胞中的酶、蛋白質、DNA等大分子的合成與活性產生一定的影響，培養溫度較最適溫度高或低，生長速率都會隨之下降[13－14]。由表2及圖2可知，鼠李糖乳桿菌HCS01-003的生長隨溫度升高呈上升趨勢，當培養溫度為37℃時，測定的OD值及收率均最高，隨后隨溫度的升高呈下降趨勢。故鼠李糖乳桿菌HCS01-003最佳培養溫度為37℃。

表2 培養溫度對菌體生長的影響

圖2 培養溫度對菌體生長的影響

2.2.2 初始pH值對菌體生長的影響

初始pH值對乳酸菌生長具有一定的影響，過低會使培養基過早酸化，過高則會堿化培養基，均會抑制乳酸菌的生長[15]。固定培養溫度為37℃，接種量為4%，靜置培養，分別考察初始pH值為6.40，6.60，6.80，7.00，7.20條件下菌懸液吸光度和菌泥收率。結果見表3及圖3，鼠李糖乳桿菌HCS01-003適合弱酸環境下生長，當初始pH值為6.80時，OD值較高，收率明顯高于其他組，為最佳適初始pH值。

圖3 培養基初始pH值對菌體生長的影響

表3 初始pH值對菌體生長的影響

2.2.3 需氧型對菌體生長的影響

固定培養溫度為37℃，接種量為4%，初始pH值為6.80，分別測定靜置培養和振蕩培養兩種培養方式菌懸液吸光度、菌泥收率。表4實驗結果表明，鼠李糖乳桿菌HCS01-003更適靜置培養。

表4 需氧型對菌體生長的影響

2.2.4 接種量對菌體生長的影響

不同接種量對菌體的生長存在一定的而影響，過低使菌體生長緩慢，發酵周期長，過高的接種量又會導致前期生長快，營養成分不足而提前死亡[15]。固定培養溫度為37℃，初始pH值為6.80，靜置培養，分別考察接種量4%、5%、6%條件下菌懸液的OD值和收率，優化接種量。根據表5及圖4實驗結果，隨著接種量的增加，OD值和菌泥收率均增加，當接種量5%時，菌泥收率可達到1.386%。考慮實際生產需要及成本等因素，采用接種量5%為優化后接種量。

表5 接種量對菌體生長的影響

圖4 接種量對菌體生長的影響

2.2.5 培養條件驗證結果

將經過優化后培養條件（培養溫度37℃，初始pH值為6.80，5%接種量、靜置培養）下的二級培養菌懸液，以相同條件接種到300 mL優化培養基中，靜置培養16 h，測定菌懸液的pH值、收率和活菌數，重復操作實驗3次取平均值，驗證培養條件。驗證后所得結果為活菌數2.97×109mL-1，菌泥收率1.593。

2.3 優化培養基促生長因子篩選結果

2.3.1 促生長因子單因素篩選結果

低聚異麥芽糖在動物腸道內雖無法被機體消化酶和有害菌如產氣莢膜桿菌分解利用，但卻是乳酸菌、雙歧桿菌等有益微生物定植和生長的良好培養基[16]。體外研究實驗證明低聚半乳糖及水蘇糖等低聚糖對乳酸菌具有明顯的增殖作用[17]，而維生素為乳酸菌生長提供營養。根據表6和圖5可知，添加了促生長因子后，鼠李糖乳桿菌經三級培養后的菌懸液活菌數與空白對照相比明顯增多，其中添加低聚異麥芽糖的為最多，其次是水蘇糖和低聚半乳糖，維生素B5、維生素B12、維生素B2促生長效果不明顯，這表明所選的促生長因子對該鼠李糖乳桿菌的生長均有一定的促進作用，其中促生長作用較顯著的為低聚異麥芽糖、水蘇糖、低聚半乳糖。

表6 單因素篩選菌懸液活菌數

圖5 單因素篩選菌懸液活菌數對比結果

2.3.2 促生長因子添加量篩選實驗結果

2.3.2.1 低聚異麥芽糖添加量對菌體生長的影響。

根據圖6所示，隨著低聚異麥芽糖添加量的增加，菌懸液活菌數先增加后減少。當低聚異麥芽糖添加量在1～2 g/L時，菌體活菌數較高，故選用1 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L作為低聚異麥芽糖的實驗水平。

圖6 低聚異麥芽糖添加量對菌體生長的影響

2.3.2.2 水蘇糖添加量對菌體生長的影響。

由圖7可知，菌體活菌數隨著水蘇糖添加量的增加而加大，當添加量為2.0 g/L時，活菌數則保持平穩狀態，所以選用1.5、2.0、2.5 g/L作為水蘇糖的實驗水平來考察水蘇糖的最適添加量。

圖7 水蘇糖添加量對菌體生長的影響

2.3.2.3 低聚半乳糖添加量對菌體生長的影響。

由圖8可知，當低聚半乳糖添加量為2 g/L時，活菌數最高，其次是2.5 g/L和1.5 g/L，故選用1.5、2.0、2.5 g/L作為低聚半乳糖的實驗水平來考察水蘇糖的最適添加量。

圖8 低聚半乳糖添加量對菌體生長的影響

2.3.3 正交實驗結果

由表8所示，根據R值可知，在培養基中復合添加三個促生長因子時對鼠李糖乳桿菌的促生作用順序為A＞C＞B，即低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖＞水蘇糖。由k值可知，A1B1C2為最優組合，即低聚異麥芽糖1 g/L，水蘇糖1.5 g/L，低聚半乳糖2 g/L。2.3.4驗證實驗

表7 正交實驗因素水平表

表8 正交實驗結果與分析

將正交實驗結果中的最優組合，即低聚異麥芽糖1 g/L，水蘇糖1.5 g/L，低聚半乳糖2 g/L（均為質量濃度）添加到優化培養基中，采用上述相同的方法培養鼠李糖乳桿菌，培養結束后，取菌懸液檢測活菌數，檢測結果為7.8×109mL-1，活菌數最高。根據單因素實驗結果及正交實驗結果，活菌數僅次于最優組合的是僅添加低聚異麥芽糖1.5 g/L和正交實驗1組，結果均為7.7×109mL-1，均符合生產要求，考慮到生產成本，選擇促生長因子方案為低聚異麥芽糖1.5 g/L。

3 討論

鼠李糖乳桿菌是應用最廣泛的益生菌，能夠抗氧化、增強機體免疫力等[18]。然而發揮益生作用不僅需要代謝產物，菌體活性也十分關鍵，培養溫度、接種量及初始pH值等培養條件對乳酸菌素產量均有直接或間接影響[19-20]。本研究中培養溫度、培養基初始pH值及接種量等，隨著培養條件的改變，菌體的生長均會隨之呈上升或下降趨勢，與菌體生長特性有關。促生長因子的作用根據圖5可知，與空白對照相比，低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖、維生素B2、維生素B5、維生素B12對鼠李糖乳桿菌的培養都有促生長作用，而低聚異麥芽糖和水蘇糖的促生長作用較大，可能是因為低聚異麥芽糖和水蘇糖都具有α-1，6糖苷鍵功能鍵，且聚合度都較低有關。

4 結論

通過單因素實驗優化了鼠李糖乳桿菌HCS01-003培養條件，以菌懸液OD、菌泥收率及活菌數為考察指標，研究了培養溫度、培養基初始pH值、需氧型及接種量對菌體生長的影響，以優化最佳培養條件。選取了6種對鼠李糖乳桿菌生長有促進作用的促生長因子，添加到優化培養基中，根據菌株在培養基上的菌落生長情況來研究6種促生長因子對鼠李糖乳桿菌生長的促進作用，并從中篩選出最佳的促生長因子及復合添加的最優組合。

培養條件優化結果最適培養溫度為37℃、培養基初始pH值為6.8、接種量5%、靜置培養。通過單因素篩選實驗，確定了6種促生長因子對該鼠李糖乳桿菌的促生長作用依次為低聚異麥糖、水蘇糖，低聚半乳糖、維生素B5、維生素B12、維生素B2。選取了促生長作用較顯著的低聚異麥芽糖、水蘇糖，低聚半乳糖進行正交實驗，篩選了復合添加的最優組合，考慮到生產成本因素，確定促生長因子方案為添加低聚異麥芽糖1.5 g/L。經最適培養條件及添加優選促生長因子的優化培養基培養的鼠李糖乳桿菌HCS01-003菌懸液活菌數可達7.7×109cfu/mL。