凍干羊奶中伊維菌素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

楊趙偉，李博，李宏娟，李曼，張養(yǎng)東，李鵬，杜順豐

（1.秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，河北秦皇島066000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心,北京100193）

0 引言

伊維菌素是由阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，既不屬于抗菌化合物，也不屬于抗真菌化合物[2]，在動物寄生蟲防治中廣泛使用[3]。牛、羊等反芻動物通常采用皮下或肌肉注射伊維菌素[4]，藥物在皮下組織中的沉積，可能造成奶中藥物污染[5-6]，并在牛奶和羊奶中持續(xù)存在[7]。牛奶中伊維菌素的限量為10μg/kg[8]，而羊奶無相關(guān)規(guī)定，滯后于羊奶產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[9-11]。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以保障測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和質(zhì)量控制的有效性[12]，我國食品類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與實際需求有巨大缺口[13]，其中乳制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺失更為嚴(yán)重。乳制品基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在乳制品檢驗工作中具有重要作用[14]。本試驗研制的凍干羊奶中伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可用于羊乳中伊維菌素檢測過程中質(zhì)量控制和方法驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

U 3000高效液相色譜儀，配有FLD-3100熒光檢測器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；YZ-1A-80冷凍干燥機(jī)，北京巖征生物科技有限公司；MS3漩渦振蕩器，IKA公司；3H 20RI智能高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；USE-24S固相萃取濃縮裝置，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TTL-Ⅱ氮吹儀，北京斯珀特科技有限公司；XA205電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；HZF-A200電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；BC/BD-100HER冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司。

體況良好、體質(zhì)量35.36±3.82 kg相近的泌乳期奶山羊3只，盧龍縣亞川養(yǎng)殖場；伊維菌素注射液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL），四川維爾康動物藥業(yè)有限公司；伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥94%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；甲醇（色譜純），德國CNW公司；乙腈（色譜純），德國CNW公司；冰乙酸（色譜純），沈陽市試劑五廠；三氟乙酸酐（化學(xué)純），南京化學(xué)試劑股份有限公司；三乙胺（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；異辛烷（色譜純），德國CNW公司；N-甲基咪唑（色譜純），西亞試劑；C18固相萃取柱（500 mg/6 mL），沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和使用方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

首先，將3只健康且處于泌乳中期的奶山羊,早晨擠奶后，按每1 kg體質(zhì)量0.02 mL皮下注射伊維菌素。注射24 h后擠奶，棄去起始部分羊奶，避免微生物污染，將收集的羊奶按只存儲、自然降溫、4℃保存。同時，參照《GB/T 29696-2013牛奶中阿維菌素類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》的方法[15]，稱取2 g樣品，測定羊奶中伊維菌素的質(zhì)量濃度。實驗測得羊奶中伊維菌素質(zhì)量濃度為16.3～20.0μg/mL，將羊奶按一定比例混合，并用純凈的羊奶調(diào)整伊維菌素的質(zhì)量濃度至15μg/mL左右，緩慢混勻。然后，使用電子天平將羊奶準(zhǔn)確分裝至潔凈的西林瓶中，每瓶11.20 g，西林瓶迅速放置在不高于-20℃冰柜中預(yù)凍干不低于12 h，將盛有凍結(jié)羊奶的西林瓶在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行真空凍干，冷凍干燥機(jī)的冷阱溫度-80℃、真空度1 Pa，凍干時間不低于96 h。最后，將凍干后的西林瓶先加丁基膠塞，再加蓋鋁塑蓋，轉(zhuǎn)移至不高于-20℃冰箱保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用方法

將盛有凍干羊奶的西林瓶從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫，用10 mL單標(biāo)線吸量管加入純水溶解。加水溶解時，先少量加水，靜置數(shù)秒，待西林瓶中凍干羊奶部分溶解并有足夠的空間后加入剩余純水，充分溶解、混勻，供試。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗

該實驗制得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的數(shù)量為300個，依據(jù)JJF 1006-1994[16]、JJF 1343-2012[17]的相關(guān)規(guī)定，從實驗總樣本中隨機(jī)抽取15瓶，進(jìn)行單元間均勻性檢測，每瓶平行測定3次，進(jìn)行單元內(nèi)均勻性檢測。使用上述高效液相色譜法定量，對檢測結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（F檢驗法），評價樣品的均勻性。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗

依據(jù)JJF 1006-1994[16]、JJF 1343-2012[17]的相關(guān)規(guī)定，按照先密后疏的原則，進(jìn)行短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性考察。在25℃條件下，于0，1，4，7，14 d檢測樣品中的伊維菌素含量，考察樣品的短期穩(wěn)定性；在4℃和-20℃條件下，于0，1，2，4，6月檢測樣品中的伊維菌素含量，考察樣品的長期穩(wěn)定性。每次檢測隨機(jī)取3瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品，每瓶樣品平行測定3次，取3次數(shù)據(jù)的平均值作為最終定量結(jié)果。

使用上述高效液相色譜法定量，采用（經(jīng)典）線性模型對定量結(jié)果進(jìn)行分析，考察線性關(guān)系的斜率隨樣品穩(wěn)定性變化的變化值。穩(wěn)定性評估基本模型表示公式為Y=β0+β1X,β0、β1為回歸系數(shù)，X為時間，Y為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值。

斜率估算公式為

截距計算公式為

β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(β1)計算公式為

直線上每點的標(biāo)準(zhǔn)偏差s計算公式為

式中：Xi是第i個時間點；Yi是第i個時間點的觀測值；是所有時間點的平均值；是所有觀測值的平均值；n是測量次數(shù)。

基于β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差，用t-檢驗進(jìn)行判斷，若|β1|

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值和不確定度評定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

依據(jù)JJF 1343-2012[17]的相關(guān)規(guī)定，本研究選擇8家通過資質(zhì)認(rèn)定的實驗室，使用上述定量方法，為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合作定值。每家實驗室測定3個樣品，每個樣品測定2次，各實驗室報告單次測量結(jié)果用于數(shù)據(jù)評估和標(biāo)準(zhǔn)值的確定。

所得測量結(jié)果的正態(tài)分布檢驗使用夏皮洛-威爾克法，其統(tǒng)計量為；本研究中n=48，則分子下標(biāo)的K值為1～24，系數(shù)aK由JJF 1343-2012[17]中表D.4查得。若統(tǒng)計量W>W(n，p)，則所得數(shù)據(jù)為正態(tài)分布。

組內(nèi)可疑值檢驗使用迪克遜檢驗，將測定數(shù)據(jù)按由小到大的順序排列，按JJF 1343-2012[17]中表F.1計算r1值和rn值，查找f（a，n），若r1和rn值均小于f（a，n），則所有數(shù)據(jù)保留。

所有數(shù)據(jù)經(jīng)評估合格后，計算總平均值作為標(biāo)準(zhǔn)值。

1.5.2 不確定度評定

依據(jù)JJF 1343-2012[17]的相關(guān)規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度。均勻性引起的不確定度為

式中：sbb為瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差；和分別為組間方差和為組內(nèi)方差（見表1）；n為組內(nèi)測量次數(shù)3。

穩(wěn)定性引起的不確定度us包括長期穩(wěn)定性不確定度ults和短期穩(wěn)定性不確定度usts，us=s(β1)·X，式中s(β1)為β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差（見表2，表3），X為保存期限。

8家實驗室使用一種方法聯(lián)合定值，定值引入的不確定度為平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，即

式中：Yi為各實驗室定值結(jié)果平均值；Y為各實驗室定值結(jié)果總平均值（見表4）；p為參與定值實驗室數(shù)量；s為各實驗室定值結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

計算上述各不確定度的相對不確定度ubb,rel、ults,rel、usts,rel、uchar,rel，合成不確定度為

k=2時，相對擴(kuò)展不確定度UCRM,rel=k·uCRM。最終可計算擴(kuò)展不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣本的制備和使用方法

本實驗通過皮下注射伊維菌素，使泌乳羊生產(chǎn)含有伊維菌素的羊奶，經(jīng)混合、分裝、凍干、評審、定值而得，是為自然基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)雖然目標(biāo)藥物濃度低于加料基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然而與實際樣品基本一致，真實的反映了藥物在動物體內(nèi)代謝結(jié)合的情況[12]。

本研究中伊維菌素的注射量嚴(yán)格參照藥物的使用說明執(zhí)行，所得樣品與生產(chǎn)中羊奶一般無二。經(jīng)測定，羊奶中伊維菌素含量為16～20μg/mL，高于牛奶中伊維菌素的殘留限量[8]，因此，有必要開展羊奶中伊維菌素的檢測和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。混合調(diào)整伊維菌素濃度至15μg/mL左右，該濃度高于殘留限量，略低于現(xiàn)實樣品，且與兩者接近，便于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，反應(yīng)真實樣品的測量情況，可以很好的控制檢測效果，滿足實際監(jiān)測的需要。

藥物殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多采用凍干的方式保存[18-22]，凍干粉均勻性好、穩(wěn)定性好、易保存，可以通過復(fù)水或其他手段使得凍干粉盡可能恢復(fù)日常分析形態(tài)，但是與實驗室任務(wù)樣本形態(tài)往往不同[23]。本研究一個西林瓶分裝11.20 g樣本，凍干后，需要10.00 mL純水復(fù)溶，使用10 mL單標(biāo)線吸量管移取，方便、準(zhǔn)確，復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)形態(tài)與任務(wù)樣本相同。需要注意的是，復(fù)溶后的樣本應(yīng)盡快使用，不得留存。

2.2 均勻性檢驗

均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重要屬性之一，是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)順利研制的基礎(chǔ)[24]，凡成批制備并分裝成最小包裝單元的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，必須進(jìn)行均勻性檢驗[16]。本實驗中分裝時緩慢攪拌，避免出現(xiàn)靜置沉淀現(xiàn)象，使用電子天平分裝，復(fù)溶時用單標(biāo)線吸量管，保證了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗結(jié)果如表1所示，如表所示統(tǒng)計量F小于F0.05(14,30)，符合JJF 1006-1994[16]中均勻檢驗合格要求。因此，該凍干羊奶中伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻。

表1 羊奶中伊維菌素均勻性檢測結(jié)果 μg/kg

2.3 穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)又一重要屬性，穩(wěn)定性檢驗是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[25]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性與生產(chǎn)者的貯存條件有關(guān)，短期穩(wěn)定性與樣品運輸過程的環(huán)境條件有關(guān)。羊奶營養(yǎng)豐富、水分含量高，常溫條件只能短期保存。本研究使用冷凍干燥技術(shù)得到羊奶凍干粉，使羊奶及其含有藥物殘留便于長期保存和運輸，快速復(fù)溶，便于使用。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表2和表3，如表所示若長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性的斜率的絕對值|β1|均小于臨界值t0.95,n-2·s(β1),符合JJF 1343-2012[17]中穩(wěn)定性檢驗合格要求，該凍干羊奶中伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在本實驗條件下和時間內(nèi)穩(wěn)定。

表2 長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果 μg/kg

表3 短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果 μg/kg

2.4 定值和不確定度評定

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制目的在于增強(qiáng)不同實驗室測量結(jié)果互認(rèn)，因此，本實驗采用8家實驗室協(xié)同定值，如表4所示。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值時伊維菌素在高效液相色譜和超高效液相色譜均可以取得良好的峰形和響應(yīng)，見圖1和圖2。各實驗室檢測結(jié)果見表4，對檢測結(jié)果進(jìn)行評估，結(jié)果見表5。如表所示，所有數(shù)據(jù)全部保留，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為8家實驗室測定結(jié)果的總平均值為15.3μg/kg。

表4 羊奶中伊維菌素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值數(shù)據(jù) μg/kg

圖1 凍干羊奶中伊維菌素在高效液相色譜定值譜

圖2 凍干羊奶中伊維菌素在超高效液相色譜定值譜

表5 定值數(shù)據(jù)評估結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度來源包括均勻性、穩(wěn)定性和定值過程[17]。計算各來源不確定度和相對不確定度，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，最終計算擴(kuò)展不確定度，計算過程各分量和結(jié)果如表6所示。

表6 不確定度評定結(jié)果

綜合定值和不確定度評定結(jié)果，羊奶中伊維菌素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果（以羊奶計）為15.3±1.0μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本實驗通過給泌乳羊皮下注射伊維菌素，將得到羊奶經(jīng)混合、分裝、預(yù)凍干、凍干等步驟，制得一批凍干羊奶中伊維菌素自然基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性良好，其特性值（以羊奶計）為（15.3±1.0）μg/kg，k=2。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可滿足生鮮羊乳中伊維菌素檢測過程中質(zhì)量控制和方法驗證的需求，確保檢測結(jié)果的可靠性、可比性和溯源性，對增強(qiáng)不同實驗室測量結(jié)果互認(rèn)、提高我國生鮮羊乳中伊維菌素檢測水平具有積極的意義。