奶豆腐中乳酸菌的分離鑒定及風味特性研究

洋洋，烏有娜，雙全，王玉榮，郭壯

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特010018；2.湖北文理學院食品科學技術學院，湖北襄陽441053）

0 引言

內蒙古傳統奶豆腐是蒙古族、哈薩克族等少數民族喜歡食用的一種傳統乳制品，蒙語可稱為“Hurood”[1-2]，奶豆腐是以羊奶或者是牛奶中本身的環境中的微生物自然發酵而形成的[3]。當然在制作傳統奶豆腐中乳酸菌時候發揮著至關重要的作用[4]。另外奶豆腐的營養價值較高，但人們對于傳統乳制品的消費是甚少[5]，主要原因是奶豆腐的感官品質[6]較差。研究發現，奶豆腐中的微生物主要包括乳酸菌[7-9]、霉菌[10-11]、酵母菌[12]等3大類群，其中乳酸菌對傳統奶豆腐感官品質的改善發揮著重要的作用[13-15]。

本研究從內蒙古錫林郭勒盟正藍旗采集奶豆腐樣品，對其中的乳酸菌進行分離鑒定，采用電子鼻和電子舌對食品的風味和滋味進行評價，以期為后續的傳統奶豆腐的相關產業化生產提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本實驗采集的樣品來自于內蒙古錫林郭勒盟正藍旗長虹乳制品廠，研究人員于2019年3月，在內蒙古錫林郭勒盟正藍旗長虹乳制品廠、正藍旗各個奶食店等地區采集。將采集的樣品立即放置在低溫保存，及時帶回實驗室進行乳酸菌的分離純化等研究。

1.2 培養基與試劑

培養基：MRS固體培養基和MRS液體培養基，MRS固體培養基和MRS液體培養基均由國藥集團化學試劑有限公司所提供。

試劑：提取DNA所用試劑，PCR擴增和電泳檢測所用試劑，細菌基因組DNA試劑，由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.3 儀器與設備

DYY-12水平電泳儀，北京市六一儀器廠；DCodeTMSystem、UV PCDS8000凝膠成像分析系統，美國BIO-RED公司；VeritiTM 96孔梯度PCR擴增儀，美國AB公司；SA402B電子舌，武漢高科南新貿易有限公司；PEN 3電子鼻，德國Airsense公司。

1.4 乳酸菌的分離純化及保存

奶豆腐、酸馬奶等樣品中的乳酸菌計數方法是采用涂布培養法。奶豆腐樣品使用刀具切成粉末，稱取1 g到15 mL無菌石蕊牛乳中，37℃培養24 h，再用涂布平板法對樣品進行稀釋涂布，37℃培養48 h，獲得樣品中的不同菌落，觀察并記錄菌落形態（顏色、大小、形態等），挑取不同的特征菌落，于對應的固體培養基上劃線2～3次，直至獲得純培養物。經革蘭氏染色，過氧化氫酶實驗，將疑似乳酸菌的純培養物在30%甘油里保藏，以待后續實驗。

1.5 DNA的提取及純度的檢測

采用CTAB法提取分離菌株的基因組DNA[16]，按照MVEOBIANG-A[17]等方法提取乳酸菌總DNA在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上跑膠檢測。

表1 PCR反應體系[18]（25μL）及擴增程序

擴增完成之后，將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測到，如在1 500 bp處有明亮條帶且無拖尾現象、即PCR擴增成功，再使用PCR清潔試劑盒對PCR產物進行純化，PCR產物連接到pMD18-T載體后，進行克隆并送由武漢呢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.6 同源性分析

將測序得到的16S rRNA基因序列在NCBI的GenBank數據庫進行BLAST對比，根據各個菌株的序列同源性選取相似度較高的模式菌株，再使用Mega5.0的鄰接法構建系統發育樹，再進行所分離菌株的系統發育關系。

1.7 奶豆腐的滋味和風味品質評價

1.7.1 奶豆腐滋味品質的評價

將奶豆腐切成粉末稱取30 g放入樣品瓶中，加等體積的純水稀釋5倍，3 000 g離心10 min，去上清夜待用。將上清夜放入樣品瓶后按照王玉榮等方法[19]使用SA402B電子舌對其鮮味、苦味、酸味、苦味和咸味及后味A（澀的回味）、后味（苦的回味）和豐度（鮮的回味）進行測定。

1.7.2 奶豆腐風味品質的評價

將奶豆腐樣品進行預處理后，10 g放入樣品瓶中置于40℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，參照楊成聰[20]的方法，使用PEN 3電子鼻對其風味進行評價，其中測試時間為60 s，然后取49、50、51的數據再進行分析。

1.8 數據分析

本實驗使用主成分分析對奶豆腐的滋味整體結構的差異性分析，使用MAGA5.0構建系統發育樹，使用Origin2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

2.1.1 乳酸菌分離菌株的菌落形態及表型特征

根據乳酸菌的形態學特征，初步從8份樣品中共分離出33株疑似乳酸菌的菌株。在MRS固體培養基上菌株的菌落呈現中等大小不一，乳白色、邊緣整齊，有一些菌落的表面光滑，而有些粗糙，如圖1。經革蘭氏染色實驗以及過氧化氫酶實驗反應，即為革蘭氏陽性菌和過氧化氫酶陰性菌。將33株菌初步定為乳酸菌。

圖1 部分菌株固體培養基菌落形態

2.1.2 系統發育樹的構建和乳酸菌鑒定結果

由圖2可以看出，NDF4-3、4-5、4-5、4-10、5-1、5-5、5-6、6-1、6-2、6-3、6-5、6-8菌株與Lactobacillus delbrueckii聚為一類群，且從表2可以看出來同源性為99%，故將其鑒定為Lactobacillus delbrueckii。NDF5-2、6-4、6-6、6-7、7-3菌株與Lactobacillus fermentum聚為一類群，且同源性為99%，因此可以鑒定為Lactobacillus fermentum。NDF2-1、2-3與Enterococcus faecium聚為一類群，且同源性為99%，因此歸為Enterococcus faecium。而NDF3-1、7-1、7-2、8-1菌株與Pediococcus acidilactici聚為一類群，并且同源性為99%，所以可鑒定為Pediococcus acidilactici。NDF1-1、1-3、1-5、1-6、2-2、2-4、2-5、3-4、3-5菌株與Lactococcuslactis聚為一類群，并同源性為99%，因此鑒定Lactococcus lactis。然而NDF8-3菌株與Lactococcus garvieae聚為一類，且同源性為99%，因此可以鑒定為Lactococcusgarvieae。

圖2 基于奶豆腐中乳酸菌16SrDNA基因的系統發育樹

表2 NDF1-NDF8分離菌株16SrDNA基因序列比對結果

2.2 奶豆腐滋味和風味品質的評價

奶豆腐各滋味指標相對強度的箱型圖如圖3所示。由圖3可知，奶豆腐的滋味品質之間是存在較大的差異，其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味及后味A（澀的回味）和后味B(苦味的回味)的極差值是都超過1，其中奶豆腐的苦味的組內差異是最大的。基于傳統電子鼻技術，奶豆腐的風味指標的強度如表3所示。

圖3 奶豆腐不同滋味的箱型圖

由表3可知，所有奶豆腐的各風味指標之間存在著較大的差異，響應值存在比較差異較大的傳感器為W 1S、W 5S、W 1W，其說明奶豆腐的揮發性風味物質的主要差異是在氫氧化物和甲烷以及有機硫化物、萜類物質上。)

表3 化學傳感器及其對應的敏感物質類型

3 結論

從內蒙古錫林郭勒盟正藍旗采集了8份奶豆腐樣品，通過傳統的培養方法，共分離到了33株乳酸菌。對這些乳酸菌進行了鑒定，結果顯示它們分別屬于德式乳桿菌、發酵乳桿菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌、戊糖片球菌、瑞士乳桿菌等6個菌種，歸為乳桿菌，腸球菌和片球菌3個乳酸菌屬。且奶豆腐樣品的揮發性風味物質的主要差異是顯示在氫氧化合物、甲烷以及有機硫化物和萜類物質上是有較大的差異，而奶豆腐中的苦味組內差異是相對于其它滋味是較大的。