DNA甲基化對奶牛乳腺上皮細胞乳脂和乳糖合成的影響

張巖，夏安婷，劉青悅，劉杰，魏翔飛，曲波，姜毓君，王春梅，張莉

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引言

DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNMT）的作用下在Cp G二核苷酸的胞嘧啶上添加一個甲基的過程[1]。DNA甲基化通過抑制轉錄因子與基因啟動子的結合，從而抑制基因的轉錄，在細胞分化、胚胎發育和疾病發生發展上發揮著重要作用[2-4]。近年來，隨著表觀遺傳學研究的深入，DNA甲基化在奶牛乳腺發育與泌乳生物學中的調控機制引起了越來越多研究者的重視[5-6]。乳脂是牛奶中主要的營養物質，乳糖是牛奶中主要的碳水化合物，二者決定了奶牛的產奶量及乳品質[7]。實驗室前期研究發現高產奶牛和低產奶牛的一些泌乳相關基因啟動子甲基化水平存在顯著差異，因此本實驗利用奶牛乳腺上皮細胞模型來探究DNA甲基化水平對奶牛乳脂和乳糖合成的影響，以期為泌乳調控提供研究基礎。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

主要試劑：CK18抗體（Cell Signaling Technology），FITC標記驢抗兔二抗（北京博奧森），胎牛血清，I型膠原酶（Gibco），DMEM-F12培養液（Hyclone），lipofectamineTM3000（Thermo Scientific），Taq DNA聚合酶、Hind III和Kpn I限制性內切酶（Takara），RNA微量提取試劑盒（Magen），ReverTar Ace qPCR RT Kit（上海TOYOBO），THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（上海TOYOBO），Bovine milk fat ELISA KIT、Bovine lactose ELISA KIT（上海酶聯生物），E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid Mini Kit I（美國Omega）。

主要儀器：PCR儀，美國Eppendorf；熒光定量PCR儀，Roche，LightCycle480；M odel 680酶標儀，美國IORAD；CO-150型CO2培養箱，美國Eppendorf；DFC280倒置相差顯微鏡，德國Leica；激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica；TAL-16A臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養與鑒定

按照本實驗室奶牛乳腺上皮細胞培養和鑒定的標準進行奶牛乳腺上皮細胞的培養與鑒定[8]。將體外分離得到的奶牛乳腺組織用胰酶消化得到原代奶牛乳腺上皮細胞，在5%CO2、37℃的條件下，使用含有10%血清和100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DF12培養液貼壁培養。純化后，采用免疫熒光染色法對細胞進行角蛋白18的染色鑒定，使用FITC標記的熒光二抗標記角蛋白18，DAPI標記細胞核。

1.2.2 DNMT 3A過表達載體的構建

采用RNA提取試劑盒提取奶牛乳腺上皮細胞總RNA，反轉錄成cDNA作為模板，根據NCBI數據庫中奶牛的DNMT 3A的mRNA序列設計特異性引物，進行PCR擴增，將膠回收產物與pcDNA3.1載體分別使用Hind III和Kpn I進行雙酶切，連接、轉化、測序。測序成功的陽性克隆經擴大培養，提取質粒備用。PCR擴增引物如表1所示。表1中下劃線處為Hind III和Kpn I酶切位點，酶切位點前為保護堿基。質粒提取采用美國Omega無內毒素質粒提取試劑盒，具體操作按照說明書進行。

表1 PCR引物序列

1.2.3 奶牛乳腺上皮細胞的轉染

將奶牛乳腺上皮細胞傳至六孔板，當奶牛乳腺上皮細胞貼壁培養至70%～80%的密度時進行轉染。空白對照組（blank組）、pcDNA3.1空載體組（control組）、DNMT 3A過表達質粒組（pcDNA3.1-DNMT3A組）均按照實驗要求用脂質體3000進行轉染，具體操作按照說明書進行。轉染后在CO2培養箱中（5%CO2，37℃）繼續培養48 h，收樣進行后續實驗。

1.2.4 RNA提取與熒光定量PCR

采用RNA提取試劑盒提取奶牛乳腺上皮細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉錄成cDNA作為模板，按照SYBR qPCR試劑盒說明書配制20 uL反應體系，使用兩步法進行熒光定量PCR，引物序列如表2所示。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.2.5 乳糖與乳脂檢測

細胞轉染48 h后，收集細胞培養液，按照乳脂和乳糖試劑盒說明書進行操作，檢測奶牛乳腺上皮細胞中乳脂和乳糖的含量。

1.2.6 數據處理與統計分析

使用Graphpad prism統計軟件對至少3個獨立實驗的數據進行分析和作圖，組間比較用單因素方差分析，組內比較用t檢驗并對多組進行了單因素方差分析。P＜0.05（*）表示具有統計學顯著性差異，P＜0.01（*）表示具有統計學極顯著性差異。

2 結果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的鑒定

奶牛乳腺上皮細胞經分離純化培養后，采用免疫熒光染色法檢測奶牛乳腺上皮細胞的特征蛋白CK18的表達，結果如圖1所示，細胞核被DAPI染成藍色，CK18呈綠色熒光，說明本研究分離純化后得到的是奶牛乳腺上皮細胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18的鑒定

2.2 DNMT3A過表達載體的構建

本實驗提取的奶牛乳腺上皮細胞總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后檢測結果如圖2（a）所示，RNA質量較好，可用于后續實驗。以上述RNA反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增的擴增結果如圖2（b）所示，獲得的基因片段長度約為2851 bp，將PCR產物送去測序。測序成功后，將PCR產物膠回收與真核表達載體pcDNA3.1（+）進行連接。將得到的重組質粒以T7為前引物送去哈爾濱博仕生物公司測序，測序結果用DNAMAN 7.0軟件分析，結果證明pcDNA3.1-DNMT3A重組質粒構建成功。

圖2 DNMT3A的PCR擴增結果

2.3 DNM T3A的mRNA表達變化

將pcDNA3.1-DNMT 3A重組質粒轉染奶牛乳腺上皮細胞48 h后，收集細胞提取總RNA，反轉錄后通過qRT-PCR方法檢測DNMT3A mRNA的表達。結果如圖3所示，與空白對照組（blank組）相比，pcDNA3.1空載體組（control組）奶牛乳腺上皮細胞的DNMT3A的mRNA表達無明顯變化；與空白對照組（blank組）和pcDNA3.1空載體組（control組）相比，pcDNA3.1-DNMT 3A重組質粒組（DNMT3A組）奶牛乳腺上皮細胞的DNMT3A的mRNA表達極顯著增加（P<0.01），說明向奶牛乳腺上皮細胞中轉染的pcDNA3.1-DNMT 3A重組質粒有效的增加了細胞中甲基化酶DNMT 3A的表達量，可以進行后續的實驗分析。

圖3 DCMECs中DNMT3A mRNA的表達水平變化

2.4 DCMECs中乳糖合成的變化

本研究采用Bovine lactose ELISA KIT繪制乳糖標準曲線，檢測樣品中乳糖濃度。結果如圖4所示，與空白對照組（blank組）相比，pcDNA3.1空載體組（control組）奶牛乳腺上皮細胞的乳糖的含量無明顯變化；與空白對照組（blank組）和pcDNA3.1空載體組（control組）相比，pcDNA3.1-DNMT 3A重組質粒組（DNMT3A組）中乳糖的含量顯著降低（P<0.05），說明過表達DNMT3A后，奶牛乳腺上皮細胞基因的DNA甲基化水平升高后，引起了乳糖的合成和分泌的降低。

圖4 DCMECs中乳糖合成的變化

2.5 DCMECs中 乳脂合成的變化

本實驗采用Bovine milk fat ELISA KIT繪制乳脂標準曲線，檢測樣品中乳脂濃度。檢測結果如圖5所示，與空白對照組（blank組）相比，pcDNA3.1空載體組（control組）奶牛乳腺上皮細胞的乳脂的含量無明顯變化；與空白對照組（blank組）和pcDNA3.1空載體組（control組）相比，pcDNA3.1-DNMT 3A重組質粒組（DNMT 3A組）中乳脂的含量也顯著降低（P<0.05），說明過表達DNMT 3A后，奶牛乳腺上皮細胞基因的DNA甲基化水平升高后，也引起了乳脂的合成和分泌降低。總的來看，DNA甲基化水平升高對奶牛乳脂和乳糖的合成具有抑制作用。

圖5 DCMECs中乳脂合成的變化

3 討論

DNA甲基化作為表觀遺傳學最重要的修飾方式之一，近年來受到越來越多的關注[9]。DNA甲基化主要發生在Cp G二核苷酸中胞嘧啶的5'端，通常會抑制基因的轉錄[10-11]。Wang等發現LPS處理牛的子宮內膜細胞，會降低IL-6和IL-8基因的表達，而這種變化是由啟動子甲基化所引起的[12-13]。奶牛的產奶量受到多種因素的影響，環境、激素、疾病等都會對奶牛乳腺上皮細胞的數量和活性有重要的調節作用，進而影響泌乳[14]。在奶牛泌乳過程中，如果泌乳相關基因的甲基化狀態發生改變，則直接會對奶牛的產奶量和產乳品質等產生重要的影響[15]。Liu等[16]分析了與奶牛產奶量密切相關的基因EEF1D和RPL8的甲基化變化，發現干奶期它們的DNA甲基化水平低于泌乳期，另外，有研究表明，大多數奶牛乳腺炎和基因的DNA甲基化調節也密不可分。乳腺炎是奶牛疾病中最為普遍的一種[17]，它會導致牛奶產量減少，影響乳品質，從而導致巨大的經濟損失[18-19]。Mao等的研究發現在患有乳腺炎的母牛中，CXCR 1基因的外顯子區域的Cp G島的90%以上的Cp G位點呈甲基化狀態[20]。這些研究表明DNA甲基化與奶牛泌乳密切相關。乳脂是影響牛奶質量的主要因素。在乳腺中，乳脂有一半來自于日糧中的脂肪，另外一半則都來源于乳腺上皮細胞合成[21-23]。乳糖也是決定奶牛產奶量的主要因素，這是由于其滲透壓的特性會導致乳腺上皮細胞的高爾基體吸收水分[24-27]。本研究結果表明，過表達DNMT 3A后，奶牛乳腺上皮細胞中乳脂和乳糖的合成減少，這種變化應該是與乳脂和乳糖合成的相關基因的甲基化水平升高引起的，具體機制仍需進一步探究。本研究為表觀遺傳學在奶牛泌乳中的調控作用和機制研究提供了理論研究基礎，為一些奶牛疾病的機制研究提供前期研究基礎，從而為提高奶牛泌乳質量和泌乳產量服務。