TGF-β/Smad/RUNX3信號通路在糖尿病腎病大鼠腎小管上皮細胞EMT過程中的作用*

潘春勤 周學才 杜鵬舉 劉杰

(長江大學附屬仙桃市第一人民醫院 1.腎病內科;2.心血管內科,湖北 仙桃 433000)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要并發癥，是導致其死亡的主要原因，DN的特征是：腎小球硬化、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)增多、間質纖維化[1-2]，ECM和上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腎間質纖維化的發生發展密切相關[3]。轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是促纖維化因子，TGF-β1可以誘導DN的ECM沉積和腎小管上皮細胞的EMT發生[4]。Smad是TGF-β1下游基因，抑制TGF-β1/Smad信號通路可以抑制EMT和腎間質纖維化[5]。Runt相關轉錄因子3(Runt-related transcription factor 3,RUNX3)屬于矮結構域家族，在腎細胞癌中RUNX3可以靶向miR-6780a-5p /E-cadherin /EMT信號轉導軸，抑制腎癌細胞的遷移和侵襲[6]。目前關于DN中TGF-β/Smad/RUNX3通路發揮作用的報道較少，本研究通過觀察在DN大鼠中TGF-β、Smad、RUNX3表達變化，探究TGF-β/Smad/RUNX3通路在DN大鼠腎小管上皮細胞EMT中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取6周齡SPF級Wistar雄性健康大鼠45只，體重120 g左右，由本院實驗動物中心提供。本實驗對大鼠的處理符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核、批準。

1.2 主要試劑及儀器 吡非尼酮(pirfenidone,PFD)(貨號：53179-13-8)購自上海邁瑞爾化學技術有限公司；鏈脲佐菌素(貨號：V900890-1G)購自SIGMA公司；白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(貨號：ml063132)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(貨號：ml02828)購自上海酶聯生物科技公司；兔單克隆α-平滑肌肌蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(貨號：SAB5500002)、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、兔多克隆TGF-β1抗體(貨號：SAB4503751)、Smad3抗體(貨號：SAB4300564)、Smad4抗體(貨號：HPA019154)、RUNX3抗體(貨號：SAB2107939)購自德國Merck公司；辣根過氧化物酶標記(HRP)的山羊抗兔二抗(貨號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；酶聯免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司；生物顯微鏡(型號：Eclipse E200)購自日本尼康公司；凝膠成像系統(型號：GelDoc EZ)購自美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 DN大鼠模型構建及分組 將45只Wistar雄性大鼠隨機分成三組：對照組、模型組和實驗組，每組各15只。實驗組和模型組參考文獻[7]構建DN大鼠模型，大鼠用高脂高糖飼料飼養1個月，造模前禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素45 mg/kg,72 h后采集大鼠尾靜脈血，血糖值>16.6 mmol /L,尿蛋白含量>30 mg/24 h,則DN大鼠模型構建成功。實驗組大鼠用TGF-β抑制劑PFD(250 mg/kg/d)灌胃，對照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，連續灌胃6周。

1.3.2 標本采集 末次給藥后，留取24 h尿液，稱取其體積后備用；腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采集腹主動脈血10 mL,一部分用于測血糖含量，一部分離心后分離血清備用；處死各組大鼠，取其腎臟組織，剪取約0.5 g用于提取組織蛋白，儲存在-80 ℃冰箱中備用，剩余腎臟組織用4%多聚甲醛溶液固定，做常規石蠟切片，備用。

1.3.3 各組大鼠生化指標檢測 用全自動生化分析儀檢測各組大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮及血肌酐含量，血糖儀檢測其血糖含量。

1.3.4 各組大鼠腎臟組織病理變化觀察 將腎臟組織切片脫蠟至水化，過碘酸希夫(Periodic acid schiff,PAS)染色和天狼星紅(Sirius Red,SR)染色，脫水，透明，封片，鏡下觀察腎臟組織病理形態學變化。SR染色檢測腎間質沉積物平均光密度，可反映腎間質纖維化程度。

1.3.5 各組大鼠血清中炎性因子水平檢測 取血清，用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法分別檢測IL-1β、IL-6表達水平，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.3.6 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達水平檢測 提取腎臟組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調整上樣蛋白至50 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜，加一抗(α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3、GAPDH,1∶1000)，4 ℃孵育過夜，次日，加二抗(1∶5000)室溫孵育2 h,洗膜，加ECL發光液，用Bio-Rad成像系統檢測蛋白灰度信號，以GAPDH為內參照，Image J軟件定量分析蛋白表達情況。

2 結果

2.1 各組大鼠生化指標檢測結果 與對照組相比，模型組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、血糖、血尿素氮、血肌酐濃度顯著升高 (P<0.05)；與模型組相比，實驗組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐濃度顯著降低 (P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠生化指標檢測結果比較Table 1 Comparison of the detection results of the biochemical indexes of rats in each group

2.2 各組大鼠腎臟組織病理變化 PAS染色結果顯示，對照組大鼠腎小球、腎小管結構完整無顯著病理變化；模型組大鼠腎小管及上皮結構損傷、腎小管肥大增生，腎間質有炎癥細胞的浸潤現象；與模型組相比，實驗組腎小管肥大減輕，炎癥細胞減少。SR染色結果顯示，對照組大鼠腎組織無膠原纖維沉積；模型組較對照組大鼠腎組織有大量膠原纖維沉積 (P<0.05)；實驗組較模型組大鼠腎組織膠原纖維沉積顯著減少 (P<0.05)。見圖1、表2。

表2 各組大鼠腎組織膠原纖維沉積結果Table 2 Results of collagen fiber deposition in kidney tissue of rats in each group

圖1 各組大鼠腎組織PAS、SR染色(標尺50 μm)Figure 1 PAS and SR staining diagrams of rat kidney tissues in each group

2.3 各組大鼠血清中炎性因子水平檢測結果 與對照組相比，模型組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達量顯著升高 (P<0.05)；與模型組相比，實驗組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達量顯著降低 (P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達量比較Table 3 Comparison of expression levels of inflammatory factors IL-1β and IL-6 in serum of rats in each group

2.4 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達水平 與對照組相比，模型組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達量顯著升高 (P<0.05)，E-cadherin蛋白表達顯著降低 (P<0.05)；與模型組相比，實驗組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達量顯著降低 (P<0.05)，E-cadherin蛋白表達顯著升高P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of the expression levels of α-SMA and E-cadherin proteins in the kidney tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠腎臟組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達Figure 2 The expression of α-SMA and E-cadherin protein in kidney tissues of rats in each group

2.5 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達水平 與對照組相比，模型組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達量顯著升高 (P<0.05)，RUNX3蛋白表達顯著降低 (P<0.05)；與模型組相比，實驗組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達量顯著降低 (P<0.05)，RUNX3蛋白表達顯著升高P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達Figure 3 The protein expression of TGF-β1,Smad3,Smad4,and RUNX3 in rat kidney tissues of each group

表5 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of TGF-β1,Smad3,Smad4 and RUNX3 protein expression levels in rat kidney tissues of each group

3 討論

DN是導致終末期腎病的重要原因，其發病率和死亡率逐年增加，對人們的生命健康和生活質量造成了嚴重危害，DN主要病理變化是腎小球硬化增大、基底膜增厚、腎間質纖維化等[8-9]。本研究發現，與對照組相比，模型組大鼠腎小管及上皮結構損傷、腎小管肥大增生，腎間質有炎癥細胞的浸潤和大量膠原纖維的沉積，大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、血糖、血尿素氮、血肌酐濃度顯著升高，與吳建波等[10]研究結果一致，表明DN大鼠模型構建成功，DN發生引起腎功能損傷。TGF-β是促纖維化因子，有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1主要在腎臟中表達，其對腎臟功能和結構穩定有重要作用，PFD是TGF-β抑制劑[11]。本研究發現，與模型組相比，實驗組大鼠腎小管肥大減輕，炎癥細胞減少，腎組織膠原纖維沉積顯著減少、24 h尿量、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐濃度顯著降低，與謝菲菲等[12]研究結果一致，提示抑制TGF-β表達可以減少腎纖維化，改善DN大鼠腎功能。

大量研究表明，隨著DN進程的發展，炎癥是影響腎功能衰退的重要因素[13-14]。IL-1β主要由被激活的單核巨噬細胞合成和分泌，IL-6是一種多功能的炎性因子。何春蘭等[15]研究顯示，DN大鼠體內IL-1β、IL-6等炎性因子釋放增加，抑制其釋放對DN大鼠有保護作用。本研究發現，與對照組相比，模型組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達量顯著升高，提示DN發生引起機體炎性因子分泌紊亂。Zhang等[16]研究顯示，抑制TGF-β1、TNF-α和IL-1β過表達，可以減少炎癥，改善腎纖維化和腎臟的病理變化。本研究發現，與模型組相比，實驗組大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6表達量顯著降低，提示抑制TGF-β表達可以減輕機體炎癥反應。

EMT是腎小管上皮細胞向成肌纖維細胞轉分化的過程，主要發生在腎臟的近端區，是導致腎間質纖維化、腎功能喪失的關鍵因素[17]。E-cadherin、α-SMA是EMT的標志物，在維持腎小管上皮細胞結構和功能中發揮重要作用。本研究發現，與對照組相比，模型組大鼠腎臟組織α-SMA蛋白表達量顯著升高，E-cadherin蛋白表達顯著降低，與張亞等[18]研究結果一致，提示DN發生促進EMT和腎間質纖維化進程。Wang等[19]研究顯示，TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT在DN的腎纖維化發生發展中起著主導作用，抑制TGF-β1可以抑制TGF-β1誘導的EMT和纖維生成。本研究發現，與模型組相比，實驗組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達量顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高，提示抑制TGF-β表達可影響DN中EMT和纖維生成。

Smads蛋白的作用主要是將信號從胞膜受體中轉移至核內，TGF-β及其受體和Smads蛋白構成了TGF-β/Smad經典的信號通路，TGF-β1與腎小管上皮細胞受體結合，使下游Smad3磷酸化后與Smad4形成復合物作用靶基因，參與EMT和腎纖維化進程[20]。RUNX3通過調控EMT與多種腫瘤的發生發展密切相關。鄭傳銘等[21]研究顯示，RUNX3可以抑制人腺樣囊性癌細胞的EMT,抑制腺樣囊性癌細胞侵襲與轉移。Gou等[22]研究顯示，RUNX3通過靶向miR-186 /E-cadherin /EMT途徑抑制肝癌細胞遷移和侵襲，為肝癌患者的有效預后指標和治療靶標。本研究發現，與模型組相比，實驗組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達量顯著降低，RUNX3蛋白表達量顯著升高，提示DN大鼠中抑制TGF-β1表達可影響Smad3、Smad4、RUNX3蛋白表達，推測TGF-β抑制劑可能通過抑制TGF-β/Smad通路激活，促進RUNX3蛋白表達，抑制腎小管上皮細胞EMT和腎間質纖維生成。

4 結論

在DN大鼠腎小管上皮細胞EMT過程中，TGF-β抑制劑可通過抑制TGF-β/Smad通路激活促進RUNX3表達，減少DN大鼠腎間質纖維化、促炎因子分泌，抑制腎小管上皮細胞EMT發展，改善DN病理癥狀，但TGF-β/Smad對RUNX3基因的具體作用機制還需要進一步研究。