談生物試題中的PCR衍生技術高考考查要點

郭勝超

摘? ? 要：PCR技術已被廣泛應用于生物的很多領域，也是命制生物高考試題的重要素材來源。本文從高中生物試題的角度，分析介紹PCR衍生技術的原理、步驟和應用，旨在引導廣大教師和學生關心和關注日新月異的生物科技發展，提高學生的生物學核心素養。

關鍵詞：PCR;引物;擴增;考查載體

PCR是多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction）的縮寫，該技術是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年發明的。現已被廣泛應用于法醫鑒定、環境監測、分子克隆、基因序列分析、考古學等重要領域。PCR技術促進了分子生物學、遺傳學、生物化學等學科的發展，也是高考評價體系中考查載體的重要來源。目前PCR的衍生技術種類繁多（見表1），本文針對常見的PCR技術在命制高中生物試題中的應用進行了整理和分析。

例1? 新冠疫情的快速控制，離不開政府的科學決策和我國對新冠病毒（RNA病毒）的快速檢測能力。熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監測系統接受到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成（如圖1）。隨著PCR的進行，熒光信號的強度也等比例增加，可通過熒光強度的變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖（如圖2）。Ct值（循環閾值）的含義為：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。下列說法不正確的是（C）

A.檢測新冠病毒時，需加入逆轉錄酶將新冠病毒RNA轉化為cDNA

B.PCR的每個循環包括變性、復性和延伸3個階段

C.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數目越多，患者危險性越高

D.圖2出現平臺期的最可能原因是反應體系中的引物、探針數量一定

1.逆轉錄PCR技術（RT-PCR）

新冠病毒屬于RNA病毒，在例1的檢測中涉及到逆轉錄PCR技術。其步驟如圖3所示：（1）逆轉錄過程需要加入逆轉錄酶、引物P1和原料，將新冠病毒的RNA逆轉錄為cDNA。（2）再以cDNA為模板，利用引物P2合成目的基因片段。（3）利用引物P1和P2對目的片段進行PCR擴增。進行上述操作，選用的模板RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。

考查載體：逆轉錄PCR技術可用于獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統等，還可以用來分析不同組織細胞，或是相同組織細胞在不同發育階段中mRNA表達情況。

2.熒光定量PCR（RTFQ-PCR）

例1中的熒光定量PCR技術是一種在DNA擴增反應中，利用熒光探針（熒光染料或熒光標記的特異性的DNA單鏈，它的兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，如圖2所示）對PCR產物進行標記跟蹤，結合相應的軟件可以對產物進行分析，推測待測樣品濃度的方法。每擴增一次，就有一個熒光分子生成。根據題干信息可知，待檢測樣本中的病毒越多，每次消耗的熒光探針就越多，發出的熒光越強，達到設定熒光閾值所需的循環數就越小，即Ct值越小。在PCR過程中為了保證檢測結果的準確性，一般要達到或超過閾值時才能確診。當PCR擴增到一定輪次，加入的探針或引物消耗殆盡，熒光強度將達到最大值，即出現圖2中“平臺期”。

考查載體：熒光定量PCR可用于人和動物疾病的診斷、食品中微生物的達標檢測、分子生物學中的定量研究等領域。

例2（2020年江蘇高考題節選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖（以EcoR I酶切為例），請據圖回答問題：

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是②④（從引物①②③④中選擇，填編號）。

3.反向PCR技術（Inverse PCR）

例2主要考查了反向PCR技術的應用。常規的PCR技術是直接擴增兩引物之間的已知DNA片段，而該技術是利用擴增引物向相反方向擴增未知DNA序列（如圖4），從而實現對未知序列進行分析和研究的目的。因此上述試題中要選擇②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'和④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'作為引物。

在進行反向PCR技術時，先選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切核酸酶對該段DNA進行酶切，然后用DNA連接酶使帶有黏性末端的靶序列環化連接，再根據已知序列設計一對反向的引物進行PCR，最后擴增出已知序列上游和下游的未知序列。

考查載體：反向PCR技術還可用于已知序列的上、下游未知序列的測定，還可用來制備未知序列的探針。

例3大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖5所示。下列敘述正確的是（不定項選擇）（BD ）

A.第一輪PCR過程中復性所用的溫度與第二輪PCR復性的溫度是一樣的。

B.PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的性狀，該定點誘變產物需具備啟動子、終止子等結構才能進行轉錄和翻譯。

C.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產物DNA的兩條鏈。

D.將某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），屬于蛋白質工程。

4.編碼基因的特異性定點突變

編碼基因的特異性定點突變是指通過PCR等方法，插入、去除或替換個別核苷酸，最終獲得突變的基因。定點突變技術的類型很多，例3中是借助大引物進行PCR定點突變，大致步驟是（如圖6）：（1）先合成一段含突變核苷酸的DNA引物P1，并將其雜交到目的基因的DNA單鏈上，引物上的個別突變核苷酸不會影響其與DNA單鏈結合。（2）利用突變引物P1與側翼引物P2，通過第一階段的PCR擴增出如圖所示的DNA分子。（3）利用第一階段的PCR產物的單鏈作為引物，配合側翼引物P3，通過第二階段的PCR擴增出突變基因。精確設計引物是成功的關鍵，該方法操作簡單，突變的成功率較高。

考查載體：編碼基因的特異性定點突變常用于蛋白質工程，通過基因定點突變改變編碼基因的堿基序列，最終實現對蛋白質分子中某活性部位的1個或幾個氨基酸殘基序列的改變。

5.融合PCR技術

PCR技術除了可以實現編碼基因的特異性定點突變，還可以通過PCR的方法實現兩個基因的融合，即融合PCR技術。以圖7為例，要實現基因A和B的融合，需要先設計的P2引物含有基因B片段的一部分，P3引物含有基因A片段的一部分。通過PCR擴增就能分別得到含有B基因片段序列的A基因和含有A基因片段序列的B基因。然后分別取基因A、B的PCR產物單鏈搭連，互為引物，進行PCR擴增，得到融合基因A-B。最后加入引物P1和P4進行PCR，得到多個融合基因A-B的拷貝。

考查載體：隨著技術的發展，融合PCR技術逐步應用于基因敲除、基因標記、基因內部點突變、兩種基因融合等領域。

PCR的衍生技術還有很多，這里不再贅述。隨著新課程改革的深入推進，高考試題的命制越來越體現時代性和創新性，緊密結合科學技術前沿理論和工程技術領域，綜合考查學生的學科核心素養。建議教師多收集與教材知識聯系密切的生物科技素材，簡化整理后介紹給學生，培養學生快速獲取相關的生物學信息和知識遷移的能力。

■ 編輯/魏繼軍