絕經后女性骨質疏松相關基因的生物信息學分析

鄧禹，黃禾，金鴻雁

(北京大學第一醫院婦產科，北京 100034)

隨著人口老齡化的到來，我國有1.2億女性正在經歷向更年期的過渡，這約占世界更年期女性人口的23%[1]。更年期女性在絕經時，由于雌激素缺乏引起許多健康問題，如骨密度(BMD)降低、關節疼痛、潮熱、睡眠障礙等癥狀，嚴重影響生活質量[2]。據報道，絕經后骨質疏松(PMOP)的發生率為30%～55%[3]，預防和治療骨質疏松(OP)對避免PMOP的發生至關重要[4]。盡管已有研究分析了影響OP進展的關鍵分子，但是我們對影響PMOP發生和進展相關基因的了解仍不詳盡，需要深入研究[5]。

骨的發育和維持是一個動態平衡的過程，這一過程受到骨破骨細胞和成骨細胞的共同影響[6]。外周血單核細胞(PBMs)是一個研究OP的合適細胞模型[7]。對于成人外周骨骼(如股骨)來說，PBMs是破骨細胞前體的唯一來源[8]。PBMs被招募到骨重塑部位后，在接受特定刺激后形成破骨細胞[9]。研究表明，PBMs可以通過分泌一些細胞因子影響破骨細胞分化、活化和凋亡[10]。PBMs可以通過轉化生長因子-β(TGF-β)促進破骨細胞的形成[11]。PBMs的異常與OP密切相關[12]。因此，本研究利用NCBI中的GEO基因芯片公共數據庫進行數據分析，選擇芯片數據(GSE56815)作為分析對象，篩選差異表達基因，并對上調差異表達基因進行GO和KEGG富集分析，利用String數據庫分析關鍵上調差異表達基因的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，深入了解關鍵差異表達基因的生物學功能，以期篩選出影響PMOP發生和進展的關鍵分子。

材料與方法

一、研究對象及分組

利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中的高通量基因表達數據庫(gene expression omnibus，GEO)公共數據庫進行芯片數據搜索[13]。檢索詞為“Postmenopause”或“Bone mineral density”。選擇40例樣品芯片數據(GSE56815)為研究對象，其中包含了絕經后20例髖部高BMD和20例低BMD女性PBMs的RNA微陣列數據。基因表達譜中髖部高BMD組患者平均年齡為(57.2±1.9)歲，髖部BMD的平均Z值為(1.58±0.66)；髖部低BMD組患者平均年齡為(57.6±1.5)歲，髖部BMD的平均Z值為(-1.04±0.38)。為方便描述，我們將絕經后髖部高BMD組患者的PBMs數據命名為高BMD組，將絕經后髖部低BMD組患者的PBMs數據命名為低BMD組。

二、方法

1.差異表達基因的篩選：本研究使用R軟件(3.6.1版)中的Limma程序包對GSE56815數據庫中高BMD組和低BMD組的差異基因進行篩選，篩選標準為：|log2 FC|>0.379，錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05。

2.GO和KEGG富集分析：本研究使用R軟件(3.6.1版)中的ClusterProfiler程序包對篩選出的上調差異基因進行GO和KEGG富集分析，得到P<0.05的功能富集和KEGG通路。為進一步探究關鍵差異基因的功能和參與的信號通路，我們使用Metascape數據庫(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對PPI網絡分析中的關鍵差異表達基因進行GO功能富集分析[14]。

3.蛋白互作PPI網絡分析：采用String數據庫(http：//string-db.org)構建差異表達基因的PPI網絡的分析圖。首先，將所有上調的差異基因輸入String數據庫，在“Minimum required interaction score”的選項中選擇“High confidence(0.700)”生成蛋白互作PPI網絡圖，然后使用Cytoscape軟件(3.8.2版)進行可視化分析。

結 果

一、差異表達基因的篩選

通過對GSE56815數據集進行分析發現，數據庫中40例樣本的大部分基因表達量基本保持一致，說明該數據適合進行下一步分析(圖1)。

圖1 GSE56815基因表達箱線圖

對GSE56815數據集進一步分析發現，共得到40個表達差異基因，其中上調基因34個(表1)和下調基因6個；并繪制火山圖，其中紅點示上調基因，藍點示下調基因(圖2)。

圖2 火山圖

表1 表達上調的差異基因

二、GO和KEGG富集分析

為了解顯著表達上調的差異基因的功能，本研究對34個表達上調差異表達基因進行了GO和KEGG富集分析。

上調差異表達基因GO分析發現，主要富集在中性粒細胞脫顆粒、免疫反應的中性粒細胞激活、對細菌來源的分子反應、對脂多糖的反應和細胞對生物刺激的反應等功能(圖3)。

圖3 表達上調差異基因的GO富集分析

上調差異表達基因KEGG分析發現，主要富集在NOD樣受體信號通路、金黃色葡萄球菌感染、成骨細胞的分化、糖類降解和精氨酸的生物合成等信號通路(圖4)。

圖4 表達上調差異基因的KEGG分析

三、上調差異表達基因的PPI網絡及重要基因

采用String數據庫構建了上調差異表達基因的PPI網絡，其中CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、CEACAM6、TCN1和ELANE存在著互作關系(圖5)。

圖5 表達上調差異表達基因PPI網絡

四、關鍵差異表達基因GO富集分析

采用Metascape分析工具對PPI分析結果中的關鍵差異表達基因(CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、CEACAM6、TCN1和ELANE)進行GO富集分析發現，關鍵差異表達基因主要富集在中性粒細胞脫顆粒、抗菌肽、細胞外基質組織以及對脂多糖的反應(表2)。

表2 關鍵差異表達基因的GO富集分析

討 論

OP是老年人常見的全身性骨病，其特征是骨質減少和骨組織微結構破壞，骨脆性和骨折的風險增加[15]。OP可分為原發性骨質疏松癥(POP)和繼發性骨質疏松癥(SOP)兩大類。POP包括PMOP、老年性OP和特發性OP[16]。在絕經期婦女中，雌激素的缺乏會增加OP的發生風險[17]。據報道PMOP是最常見的POP，影響了超過一半的絕經后女性[18]。目前，我們尚未完全了解影響PMOP發生和進展的關鍵分子[5]。因此，進一步探究影響PMOP發生和進展的機制具有重要的社會意義。

PBMs作為破骨細胞的前體[8]，PBMs的異常與OP密切相關[12]。因此，本研究通過分析GSE56815基因表達譜中40例絕經后不同BMD患者的PBMs微陣列數據，篩選出了高BMD組表達上調差異基因34個和下調差異基因6個。PPI網絡分析顯示，CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、CEACAM6、TCN1和ELANE存在著互作關系。進一步對上述關鍵差異基因進行GO分析發現，這些關鍵差異基因主要富集在中性粒細胞脫顆粒、抗菌肽、對脂多糖的反應、細胞外基質組織，其中LTF、CEACAM8、CAMP、LCN2、MMP8和ARG1與骨代謝的聯系密切。

乳鐵蛋白(LF)，曾稱LTF，是一種鐵結合的球狀糖蛋白，屬于轉鐵蛋白超家族，主要存在于中性粒細胞分泌小泡、上皮分泌物和乳汁中[19]。LF具有重要的免疫調節功能[20]，能減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)等多種溶骨細胞因子的分泌[21]。LF存在于中性粒細胞的分泌顆粒中，它的產生受到炎癥刺激的影響[22]。LF具有多種生物學效應，除了參與抗菌和免疫調節外，它可以誘導成骨細胞增殖和分化，同時抑制成骨細胞凋亡和破骨細胞的形成，在體內促進局部骨的形成[22-23]。有研究報道，LF能促進成骨細胞系(Saos-2)的成骨分化，以及增強骨再生[24-25]。Hou等[26]研究發現，切除卵巢可顯著降低大鼠股骨以及腰2～4椎體的骨量、骨小梁厚度和骨小梁數，并增加骨小梁分離，LF或雌激素治療可以保護去卵巢大鼠骨量、維持骨小梁厚度和防止骨小梁的丟失。骨保護素(OPG)和核因子激活因子-κB配體(RANKL)是調節骨形成和骨吸收所必需的細胞因子，RANKL/OPG比值是調節骨形成和骨吸收平衡的關鍵因素。如果缺乏雌激素，將導致這一比值失衡。Hou等[26]進一步研究發現，在切除了卵巢的大鼠的骨小梁中，LF可以下調RANKL/OPG比值，從而防止骨丟失。凌冰等[27]發現，大鼠去除卵巢后，血清LF含量會降低，而且血清LF含量與大鼠的左股骨和腰椎的BMD呈正相關。綜上所述，LF在骨代謝中具有重要的作用，血清LF含量與BMD的變化有相關性，LF能否作為預測PMOP變化的指標需要進一步研究。

CEACAMs是免疫球蛋白超家族的成員，參與調節各種細胞功能，如增殖、凋亡和分化等[28]。CEACAM8是CEACAMs的成員之一，又稱CD66b，編碼糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接的糖蛋白，這種糖蛋白僅在人類粒細胞中表達。當中性粒細胞被激活時，中性粒細胞中的CD66b表達上調[29]。有研究發現，當中性粒細胞受到強烈刺激活化后可能會引起顆粒細胞中部分特定基因表達增加，如CD66b和LF，且CD66b的表達水平與LF水平呈正相關[30]。但是，CD66b的功能很大程度上還是未知的，它與LF的相關性以及BMD的關系還需要進一步研究。

CAMP基因位于人3p21.31號染色體上，編碼18-kDa的前體蛋白hCAP-18。CAMP基因的表達是由1α，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]通過Toll樣受體通路調控[31]。有意思的是，1，25(OH)2D3會顯著增加破骨細胞中CAMP的表達，但是CAMP的過表達是否會影響破骨細胞的功能需要深入研究[31]。

LCN2也稱為中性粒細胞明膠酶相關脂鈣蛋白(NGAL)，是脂蛋白家族的重要成員，是脂肪來源的細胞因子。在成骨樣細胞MC3T3-E1細胞中白細胞介素-17和腫瘤壞死因子-α會增加LCN2表達[32]。有研究發現，LCN2水平升高可能與老年人OP松性骨折的風險增加有關[33]。

MMP8屬于基質金屬蛋白酶(MMPs)家族的一員，具有降解細胞外基質的能力，參與骨骼和軟骨的發育[34]。Li等[34]發現，在去除了卵巢的大鼠中，MMP13在mRNA水平和蛋白表達水平均顯著增加，而MMP8在mRNA和蛋白表達水平均無顯著變化；MMP13蛋白表達與骨小梁分離度呈正相關，與骨小梁數目呈負相關。有研究發現，17β-雌二醇可以顯著增加成骨細胞中雌激素受體和Sirtuin-1(Sirt1)的表達水平，降低NF-κB和MMP8的表達水平，即17β-雌二醇通過調節 Sirt1/NF-κB/MMP8通路改善成骨細胞功能[35]。

精氨酸酶(ARG)是參與鳥氨酸循環的重要酶之一，它包括定位于細胞質的ARG1和位于線粒體的ARG2兩種亞型[36]。ARG1過表達時，抑制破骨細胞分化、骨吸收和一氧化氮(NO)生成[37]。有研究表明，NO可能會刺激破骨細胞分化和活性，進一步導致大鼠骨丟失[36]。ARG1可能通過調節NO來負向調節破骨細胞的分化[37]。骨代謝與CRISP3、DEFA4、HP、BPI、TCN1和ELANE之間的關系尚未見報道。

此外，本文也存在一些局限性，如本研究為了精確篩選PMOP與OP相關的差異基因，減少因數據集的不一致性造成的異質性，我們對納入的GEO數據集進行了嚴格篩選，因此最終納入的患者病例數較少，未來需要擴大樣本量進行更深入的研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析，篩選出了與絕經后高BMD組患者表達上調差異表達基因34個，其中CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、TCN1和ELANE存在相互作用，且CEACAM8、LTF、CAMP、LCN2、MMP8和ARG1與骨代謝的聯系密切，但CRISP3、DEFA4、HP、BPI、TCN1和ELANE與骨代謝的聯系還需要進一步研究。本研究篩選出的差異表達基因為研究絕經后女性骨量的變化提供了一系列的生物標記物，深入研究這些基因的生物學功能，將有助于我們了解PMOP發生和進展的分子機制。