雙黃連凍干粉通過抑制MEK-ERK信號通路誘導急性淋巴細胞白血病Nalm6細胞凋亡

楊友 ，鐘芳芳，黃喆，覃祥 ，馬文哲 ，劉文君 △

急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）由造血干祖細胞無限增殖所致，是兒童最常見的惡性腫瘤，目前治療方式主要為化療。在過去的20 年中，兒童ALL 的治療取得了顯著進展，5年生存率約80%［1］；但化療藥物不良反應大，復發和耐藥仍是目前需要克服的難題。雙黃連（SHL）由金銀花、黃芩和連翹3味中藥配伍組成，具有疏風解表、清熱解毒之功效。既往SHL 在抗細菌和病毒方面報道眾多。研究發現，其對肺炎克雷伯菌［2］、支原體［3］等細菌有抑制作用；同時SHL 含有多種抗病毒成分［4］，對人腺病毒Ⅲ［5］、甲型H1N1 流感病毒［6］、甲型H5N1 流感病毒［7］和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）［8］等多種病毒均有明顯抑制效果。在抗腫瘤方面，SHL 可抑制結腸癌［9］和肺腺癌［10］的增殖。目前尚未見SHL抗白血病作用的報道。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯反應是調節多種細胞生物學過程的關鍵信號通路。絲裂原活化蛋白激酶激酶-細胞外信號調節激酶（MEK-ERK）是其中的一條信號通路，可以調控細胞增殖、凋亡、分化等［11］。有研究發現，MEK/ERK信號轉導通路激活可以促進白血病細胞 THP-1、KG-1、HL-60、Jurkat 等增殖，抑制 K562細胞凋亡，促進血管生成與腫瘤細胞轉移［12］。本文通過探討SHL對急性B淋巴細胞白血病Nalm6細胞MEK/ERK信號通路的影響，旨在為SHL治療ALL提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 人急性B 淋巴細胞白血病細胞（Nalm6）、人急性T 淋巴細胞白血病細胞（Jurkat、Molt4）以及急性髓系白血病細胞（KG1a）均購自中國科學院上海藥物研究所。

1.2 藥物與試劑 注射用雙黃連（凍干）購自哈藥集團中藥二廠有限公司（批號：Z10960058；規格：600 mg/支）；泛凋亡抑制劑芐氧羰基-VAL-ALA-ASP-氟甲基酮（Z-VAD-FMK）［13］購自美國MedChemExpresss 公司，胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI 1640 培養液購自美國Hyclone 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京百靈克公司；Annexin V-APC 凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson 公司；hoechest33342 購自德國賽諾菲公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁公司；鼠源 β-actin 一 抗 ，兔 源 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、cleaved PARP、tBid、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、c-Myc一抗及相應二抗購自Cell Signaling 公司。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；細胞培養箱購自美國Thermo公司；AIR-TECH醫用凈化工作臺購自蘇州凈化設備公司；流式細胞儀購自美國ACEA NovoCyte 公司，酶標儀購自美國Awareness 公司；CO2細胞培養箱購自美國SHEL-LAB公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞株培養 用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640 培養液培養細胞，在37 ℃、5%CO2和95%濕度的培養箱中培養傳代，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.4.2 CCK-8法檢測細胞增殖 CCK-8測定共分為7組，其中使用不同濃度藥物梯度6 組，空白對照1 組。取對數生長期的4 種細胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸細胞至4×108個/L；按50 μL/孔接種于96孔板中，每組處理設置3個復孔；培養6 h后空白對照組每孔加入50 μL 細胞培養液，其他組分別加入50 μL SHL，使SHL 終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。培養24 h后，加入10 μL的CCK-8試劑，孵育4 h后酶標儀測定450 nm 波長處光密度（OD）值，實驗重復3 次，取3 孔平均值。按公式算出細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=［（對照組平均 OD 值-實驗組平均 OD 值）/空白組平均 OD 值］×100%，并計算半數抑制濃度（IC50）。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞周期分布及凋亡 將細胞以每孔2×106個接種于6 孔板中，分別加入不同濃度的SHL 使其終濃度為0、0.1、0.2、0.4 g/L，溫育24 h 后，收取細胞并用PBS洗滌2 次。500 μL 結合緩沖液重懸細胞，分別加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光反應15 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比。不同濃度的SHL處理后，收取細胞，用PBS洗滌2次，加入70%的預冷乙醇充分混勻，放入-20 ℃固定 6 h 后用 PBS 洗滌 2 次，加入 400 μL 的 PI 染液（50 g/L），100 μL 的RNase A（100 g/L），4 ℃避光孵育30 min后用 PBS 洗滌 1 次，加入 500 μL 的 PBS 混懸細胞，上流式細胞儀檢測細胞周期百分比。所有實驗均重復3次，取平均值。

1.4.4 Hoechst 33342 染色觀察細胞凋亡形態 Nalm6 細胞經0、0.1、0.2、0.4 g/L的SHL處理24 h，收取細胞用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗滌后加入Hoechst 33342 熒光染料（50 g/L），室溫避光孵育5 min，涂片，于熒光顯微鏡下觀察、照相，實驗重復3次。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達 Nalm6細胞經0、0.1、0.2、0.4 g/L的SHL處理24 h，收取細胞用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉膜、洗膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入1∶2 000 稀釋的tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、MEK、ERK、p-MEK、p-ERK、c-Myc、β-actin 單克隆抗體于4 ℃孵育過夜。次日洗膜后加入IRDye TM800CW 染料標記的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶1 000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min，用雙紅外激光掃描成像系統進行熒光顯色及分析，所有實驗均重復3次。

1.4.6 Z-VAD-FMK預處理后流式細胞術檢測Nalm6細胞凋亡水平變化 Nalm6細胞經Z-VAD-FMK（20 μmol/L）預處理4 h 后，加入SHL（0.2 g/L）處理24 h，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，檢測方法同1.4.3。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據處理。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度SHL 對急性白血病細胞增殖能力的影響 CCK-8 檢測結果顯示，SHL 能抑制 Nalm6、Jurkat、Molt4 以 及 KG1a 的 增 殖（圖 1）。 SHL 對Nalm6、Jurkat、Molt4、KG1a 的IC50（g/L）分別為0.11±0.01、0.29±0.01、0.25±0.01、0.32±0.04。其中 SHL 對Nalm6 的IC50最低，抑制增殖效果更強，因此選取Nalm6 細胞進行后續實驗。此外，結合細胞增殖實驗的濃度設置以及Nalm6的IC50，選取SHL質量濃度為0.1、0.2、0.4 g/L。

2.2 不同濃度SHL 對Nalm6 細胞周期的影響 流式細胞周期分析顯示，0.1、0.2、0.4 g/L SHL 對Nalm6的細胞周期分布無明顯影響（P＞0.05），見圖2、表1。

2.3 不同濃度SHL 對Nalm6 細胞凋亡的影響 流式細胞凋亡分析顯示，空白對照組及SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組總凋亡率（%）分別為 2.13±0.12、30.07±3.87、64.35±0.47、90.27±0.43，與空白對照組相比，SHL 各劑量組細胞總凋亡率均明顯升高，且隨著SHL濃度升高，細胞總凋亡率明顯升高（F=544.600，P＜0.01），見圖3。

Fig.1 Cell proliferation inhibition rates of different concentrations of SHL in acute leukemia cells圖1 不同濃度SHL對急性白血病細胞的增殖抑制率

Fig.2 Cell cycles of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL圖2 不同濃度SHL對Nalm6細胞周期的影響

Tab.1 Cell cycles of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL表1 不同濃度SHL對Nalm6細胞周期的影響（n=3，%，）

Tab.1 Cell cycles of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL表1 不同濃度SHL對Nalm6細胞周期的影響（n=3，%，）

均P＞0.05

組別空白對照組SHL 0.1 g/L組SHL 0.2 g/L組SHL 0.4 g/L組F G1期41.55±3.37 37.34±3.53 39.27±6.70 44.74±5.93 1.169 S期44.03±1.64 48.19±0.85 45.50±4.76 36.58±7.77 3.433 G2期14.42±4.85 14.48±3.24 15.23±6.67 18.59±1.99 0.567

Fig.3 Apoptosis of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL圖3 不同濃度SHL對Nalm6細胞凋亡的影響

2.4 不同濃度SHL 誘導Nalm6 細胞凋亡的形態學改變 Nalm6 細胞經Hoechst 33342 熒光染色后發現，SHL處理24 h后細胞形態發生明顯改變，細胞核內可見濃染致密的藍色顆粒熒光，呈現核固縮、核碎裂等細胞核形態改變，見圖4。空白對照組及SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組凋亡細胞數（個/視野）分別為0.33±0.58、5.67±1.53、10.33±1.53、18.67±2.52。與空白對照組相比，SHL 各劑量組細胞凋亡細胞數逐漸增多（F=63.950，P＜0.01）。

2.5 不 同 濃 度 SHL 對 Nalm6 細 胞 tBid、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9 和 cleaved PARP 蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，經SHL處理24 h后，與空白對照組相比，SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組的tBid、cleaved Caspase-9、cleaved PARP 蛋白表達升高，SHL 0.2、0.4 g/L組cleaved Caspase-3蛋白的相對表達量升高。SHL 0.1～0.4 g/L 濃度范圍內，隨著處理濃度的升高，tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達水平逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖5、表2。

Fig.4 Morphological changes of Nalm6 cell apoptosis induced by different concentrations of SHL(×400)圖4 不同濃度SHL誘導Nalm6細胞凋亡的形態學變化（×400）

Fig.5 Effects of different concentrations of SHL on expression levels of apoptosis related proteins in Nalm6 cells圖5 不同濃度SHL對Nalm6細胞凋亡相關蛋白的影響

Tab.2 Changes in apoptosis-related proteins induced by different concentrations of SHL in Nalm6 cells表2 不同濃度SHL誘導Nalm6細胞凋亡相關蛋白的變化（n=3，）

Tab.2 Changes in apoptosis-related proteins induced by different concentrations of SHL in Nalm6 cells表2 不同濃度SHL誘導Nalm6細胞凋亡相關蛋白的變化（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與SHL 0.1 g/L 組比較，c與SHL 0.2 g/L組比較，P＜0.05

組別空白對照組SHL 0.1 g/L組SHL 0.2 g/L組SHL 0.4 g/L組F tBid 0.51±0.03 0.67±0.02a 0.78±0.01ab 0.83±0.05abc 1284.000＊＊cleaved Caspase-9 0.10±0.02 0.50±0.03a 0.85±0.05ab 0.92±0.02abc 401.800＊＊cleaved Caspase-3 0.13±0.02 0.16±0.03 0.19±0.02ab 0.25±0.01abc 22.320＊＊cleaved PARP 0.31±0.01 0.46±0.02a 0.59±0.01ab 0.67±0.04abc 928.500＊＊

2.6 不同濃度SHL對Nalm6細胞中MEK-ERK信號通路蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，經SHL 處理24 h 后，與空白對照組相比，SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組 p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、c-Myc 蛋白表達均明顯下降（P＜0.05）；0.1～0.4 g/L 范圍內，隨著SHL 濃度的升高，p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、c-Myc蛋白表達逐漸下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖6、表3。

Fig.6 Effects of different concentrations of SHL on expression levels of MEK-ERK signaling pathway proteins in Nalm6 cells圖6 不同濃度SHL對Nalm6細胞MEK-ERK信號通路蛋白表達的影響

Tab.3 SHL induced changes in MEK-ERK signaling pathway proteins in Nalm6 cells表3 不同濃度SHL誘導Nalm6細胞中MEK-ERK信號通路蛋白的變化 （n=3，）

Tab.3 SHL induced changes in MEK-ERK signaling pathway proteins in Nalm6 cells表3 不同濃度SHL誘導Nalm6細胞中MEK-ERK信號通路蛋白的變化 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與SHL 0.1 g/L 組比較，c與SHL 0.2 g/L組比較，P＜0.05

組別空白對照組SHL 0.1 g/L組SHL 0.2 g/L組SHL 0.4 g/L組F p-MEK/MEK 0.87±0.01 0.75±0.02a 0.46±0.01ab 0.29±0.02abc 785.400＊＊p-ERK/ERK 0.82±0.03 0.77±0.01a 0.67±0.02ab 0.37±0.01abc 1 927.000＊＊c-Myc 0.79±0.01 0.59±0.02a 0.42±0.01ab 0.35±0.03abc 1 585.000＊＊

2.7 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 對SHL 凍干粉誘導Nalm6 細胞凋亡的影響 Z-VAD-FMK 是泛凋亡抑制劑，在加或不加Z-VAD-FMK（20 μmol/L）預處理4 h 的 Nalm6 細胞中加入 SHL（0.2 g/L）處理 24 h 后，細胞凋亡檢測結果顯示，在Z-VAD-FMK 未預處理Nalm6 細胞中，SHL 作用后的細胞總凋亡率為（64.42±3.71）%，而 Z-VAD-FMK 預處理的細胞在SHL作用后的細胞總凋亡率為（31.15±1.10）%，差異有統計學意義（t=14.892，P＜0.05），見圖7。

3 討論

目前急性B淋巴細胞白血病的治療手段主要是聯合化療，但患者用藥后不良反應大，易產生耐藥。本研究通過CCK-8法、流式細胞術檢測證實SHL可以抑制急性白血病細胞（Nalm6 Jurkat、Molt4、KG1a）增殖，誘導急性B 淋巴細胞白血病細胞（Nalm6）凋亡，推測其可能具有抗白血病的作用。

凋亡細胞內染色質聚集，經核碎裂形成大小不等的染色質塊，然后整個細胞通過出芽、起泡等方式形成一個球形凋亡小體，凋亡小體的形成是細胞發生凋亡的標志［14］。本研究通過 Hoechst 33342 熒光染色后觀察到隨著SHL 處理濃度增加，Nalm6 凋亡細胞明顯增多。凋亡又分為外源性凋亡和內源性凋亡［15］。在本研究中，Nalm6經SHL處理后，促凋亡相關蛋白tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3以及cleaved PARP 表達均顯著增高。tBid是由于外源性凋亡途徑中Capsase-8 對Bid 進行切割以后形成的，隨后tBid 轉移到線粒體外膜（OMM）上激活Caspase-9依賴的活化結構［15］，從而激活Caspase-9-Caspase-3 級聯反應使 PARP 增加［16］，導致外源性細胞凋亡。因此，SHL 可能通過外源性凋亡途徑誘導Nalm6 凋亡；同時，用凋亡抑制劑 Z-VAD-FMK 預處理Nalm6后再加用SHL，Nalm6細胞凋亡率較單獨使用SHL處理組下降，凋亡被抑制，再次確認SHL誘導Nalm6細胞的死亡方式可能是通過細胞凋亡。

MAPKs 家族蛋白由 ERK1/2、p38、c-Jun 氨基末端激酶（JNK12-13）和ERK5等分子組成。這些絲氨酸/蘇氨酸激酶可被 MEK 激活，而 MEK1 和 MEK2 是ERK1/2的特定激活劑［17］。c-Myc作為MEK-ERK信號通路下游的靶基因，其活性增加會促進腫瘤的增殖和侵襲［18］。MEK-ERK 信號通路的激活最終促進了癌細胞增殖、遷移和血管生成［19］，目前已有2 種MEK 抑制劑（trametinib 和cobimetinib）被批準用于臨床治療，而ERK抑制劑仍在進行臨床試驗［20］。本研究發現，SHL可以通過抑制MEK-ERK 信號通路，下調Nalm6 細胞中c-Myc 蛋白的表達。因此，SHL有可能作為治療急性細胞白血病的潛在藥物，但SHL進入細胞后的具體的作用靶點及其機制仍需要深入探究。

Fig.7 Effects of Z-VAD-FMK on apoptosis of SHL-treated Nalm6 cells圖7 Z-VAD-FMK對SHL誘導Nalm6細胞凋亡的影響

綜上所述，SHL可抑制Nalm6細胞增殖，并通過上調tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3以及cleaved PARP 等相關凋亡蛋白的表達誘導細胞凋亡，其作用機制可能與抑制MEK-ERK 信號通路有關。