維格列汀對糖尿病足潰瘍大鼠創面修復的影響*

王曉娟 曹海泉 袁寧 何明海

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院 1.內分泌科；2.重癥醫學科，四川 南充 637000)

創面是由于有害因素導致活體組織功能連續性中斷所致的最常見的臨床情況[1]。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)是糖尿病患者的嚴重并發癥之一，與神經病變、腎病、心肌病變、血管病變、酮癥酸中毒并列[2]。一份統計報告表明DFU的年發病率約為2%，在糖尿病人群中患病率約為4.5%～10%，66%的DFU患者需要住院治療[3-4]。由于糖尿病患者發生DFU的風險增加，導致患者生活質量下降，同時也給醫療系統帶來了巨大的經濟負擔，患有DFU的2型糖尿病患者每年的直接和間接醫療費用約為13561美元[3]。證據表明導致傷口愈合延遲的各種因素包括血糖水平升高、胰島素抵抗增加、血管生成和膠原沉積減少[5]。此外，創面的炎性浸潤及炎性因子的平衡在DFU的發生發展中也起著重要作用[6]。有報道指出，維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果[7]，但關于其對DFU創面修復的研究還尚未清晰。基于此，本研究觀察維格列汀對DFU大鼠創面修復的影響，為其治療DFU提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雌性健康、清潔級SD大鼠90只，體質量(210±10)g,購于成都達碩實驗動物有限公司，使用許可證號：SCXK(川)2019-031。飼養于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(50%±5%)環境中，自然采光，自由飲水。大鼠適應性飼養1周后隨機分為9組：空白組(3、6、9 d組)、模型組(糖尿病鼠足潰瘍)(3、6、9 d組)、維格列汀組(給藥3、6、9 d組)，每組各10只。本實驗大鼠的處理符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核、同意。

1.2 主要試劑及設備 維格列汀購自諾華公司(批號：H20160037)；白細胞介素-6(IL-6,貨號：ZC-36404)、腫瘤壞死因子α(TNF-α，貨號：ZC-37624)ELISA 試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；蘇木素染液(批號：C200301)、伊紅染液(批號：C200403)購自珠海貝索生物技術有限公司。血管內皮細胞生長因子(VEGF,貨號：ab32152)、表皮細胞生長因子(EGF,貨號：ab184265)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,貨號：ab40772)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,貨號：ab208687)一抗抗體購自英國Abcam;過氧化物酶標記羊抗兔IgG(上海晶天生物)、BMJ-A型包埋機購自常州郊區中威電子儀器廠；SpectraMAX Plus384酶標儀購自美谷分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DFU大鼠模型的建立及給藥 大鼠適應喂養1 w后，進行模型制備，除空白組外，其余大鼠造模，造模前大鼠禁食12 h,但可飲水，造模大鼠采用高糖高脂飼料喂養4～6 w,大鼠腹腔注射鏈脲佐菌(STZ)30 mg/kg誘發罹患糖尿病，用藥72 h后，自尾靜脈微量采血檢測隨機血糖，當血糖值超過16.7 mmol/L,即為糖尿病大鼠造模成功。隨后造模大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉，背部剃毛、消毒，大鼠背側后足上形成單個圓形全層皮膚潰瘍創面傷口，2～3 d后傷口局部皮膚壞死，形成DFU,造模完成。空白組大鼠正常飼料飼喂，大鼠創面造模成功后24 h,空白組和模型組灌胃雙蒸水(10 mg/kg)，維格列汀組灌胃維格列汀(57 mg/kg)，1次/d,分別于給藥后的3、6、9 d,剪取創面部位潰瘍皮膚標本。

1.3.2 大鼠創面組織病理學觀察 采集創面組織標本，4%多聚甲醛溶液固定，固定的創面組織經全自動脫水機脫水，包埋，切片，放入蘇木精中染色約10 min,自來水沖洗使切片顏色變藍，1%鹽酸酒精分化數秒鐘，使細胞核呈紫藍色，1%氨水中數秒，至返藍，1%伊紅染色3 min左右，脫水，透明，中性樹膠封存，鏡檢觀察組織病理變化。

1.3.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清炎性因子表達 按照ELISA試劑盒說明操作，檢測血清中TNF-α、IL-6表達水平。

1.3.4 免疫組織化學法檢測創面組織VEGF、EGF、E-cadherin、bFGF表達 創面組織切片，脫臘后3% H2O2室溫孵育30 min,滴加正常山羊血清后37 ℃孵育30 min,滴加一抗(VEGF、EGF、E-cadherin、bFGF)，37 ℃孵育1 h,滴加相應二抗，繼續孵育30 min。然后DAB顯色、蘇木精復染、酒精鹽酸分化、脫水、中性樹膠封片，觀片，以Image-pro plus 6.0 軟件處理和分析圖像，統計IOD值。

2 結果

2.1 維格列汀對DFU大鼠創面組織病理學變化的影響 空白組大鼠在灌胃3、6、9 d時皮膚組織表皮結構完整清晰，細胞排列整齊緊密，胞質紅染、均勻，細胞核形態正常，未見明顯病理變化。模型組大鼠在造模成功3 d時創面組織內表皮、真皮、皮下脂肪層大面積壞死脫落，細胞形態基本消失；于6 d時創面組織內表皮中復層扁平上皮層明顯增厚，表皮層細胞壞死，胞核崩解，胞核固縮崩解；于9 d時創面組織復層扁平上皮層明顯增厚，嗜酸性增強，毛囊和皮脂腺等皮膚附屬器基本壞死消失，表皮表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮，真皮層較多大量膠原纖維壞死，壞死區域可見較多炎癥細胞浸潤。維格列汀治療3 d時創面組織內表皮中復層扁平上皮層明顯增厚，表皮層細胞壞死，胞核崩解，見表皮表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮；于6 d時表皮層細胞壞死，表皮表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮，真皮層較多膠原纖維壞死，出血；治療9 d時真皮層膠原纖維壞死區域可見淋巴細胞浸潤及纖維細胞增生，亦可見新生毛細血管形成，皮下肌層清晰可見，胞核形態正常，其他未見明顯病理變化；與模型組9 d時相比，病理損傷明顯改變，見圖1。

圖1 各組大鼠創面組織病理學變化(HE,100×，400×)Figure 1 Histopathological changes in wounds of rats in each group 注：A.3 d處理組；B.6 d處理組；C.9 d處理組

2.2 對DFU大鼠血清炎性因子表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平在3、6、9 d時均明顯升高 (P<0.05)；與模型組比較，維格列汀治療3、6、9 d可明顯降低IL-6、TNF-α水平 (P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清炎性因子表達Table 1 The expression of serum inflammatory factors in each group of rats

2.3 維格列汀對DFU大鼠創面血管再生的影響 與空白組比較，模型組EGF、VEGF表達在3、6、9 d時均明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，維格列汀治療3、6、9 d可明顯升高EGF、VEGF表達 (P<0.05)。見表2、表3。

表2 各組大鼠創面組織EGF表達Table 2 Expression of EGF in wound tissue of rats in each group

表3 各組大鼠創面組織VEGF表達比較Table 3 Expression of VEGF in wound tissue of rats in each group

2.4 維格列汀對糖尿病足潰瘍大鼠創面再上皮化的影響 與空白組比較，模型組bFGF、E-cadherin表達在3、6、9 d時均明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，維格列汀治療3、6、9 d可明顯升高bFGF、E-cadherin表達 (P<0.05)。見表4、表5。

表4 各組大鼠創面組織bFGF表達Table 4 Expression of bFGF in wound tissues of rats in each group

表5 各組大鼠創面組織E-cadherin表達Table 5 Expression of E-cadherin in wound tissue of rats in each group

3 討論

DFU是一種慢性難治性臨床疾病，主要受炎癥反應受損和血糖升高的影響導致傷口延遲愈合。目前治療DFU的方法包括神經治療藥物(抗生素、生長因子、粒細胞集落刺激因子)、物理療法(如高壓氧、電物理和負壓療法)以及先進的生物工程皮膚替代物等[8]。然而，較高的費用和無應答率限制了其在DFU治療中的臨床應用。王邦瓊等[9]研究證明維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果，可能是治療DFU的一種有前途的選擇。在各種動物模型中，STZ誘導的模型重復性較高，可模擬大多數延遲傷口愈合的臨床病理條件，包括再上皮化、傷口閉合和生長因子形成[10]。本研究結果顯示，維格列汀干預后大鼠創面組織內表皮中復層扁平上皮層有所增厚，皮下肌層清晰可見，胞核形態正常，較模型組病理組織學明顯改善，提示維格列汀對DFU具有改善作用，可成為治療DFU的潛在藥物。

研究報道炎癥反應在傷口愈合過程中起著中心作用，血糖水平升高會導致過氧化物產生過多，從而刺激炎性因子的釋放，臨床上糖尿病患者與局部傷口中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高有關[11]。且支持TNF-α和延遲愈合過程之間存在直接聯系[12]。此外，TNF-α可以抑制TGF-β的激活，從而抑制膠原-1的增殖和合成，而IL-6的增加對血管生成有負面影響[13]。本研究檢測了炎性因子TNF-α、IL-6的表達，結果表明傷口愈合延遲與傷口區域炎癥反應加重有關，與Lin等[14]的研究結果一致。而維格列汀的應用顯著減少了傷口處的炎性滲出，表明其具有抗炎的潛力，創面組織的病理學結果進一步支持了這一觀點。Bandyk[15]指出改善創面愈合可以洞察疾病狀況。在本研究中，維格列汀可明顯增加STZ引起的傷口收縮率，改善了傷口延遲愈合。表明維格列汀具有抗炎癥作用，進而可以改善創面愈合。

VEGF被認為是最重要的血管生成因子，可以激活成纖維細胞的增殖，通過增加膠原蛋白的產生來促進傷口愈合[16]。然而，在糖尿病條件下，創面不良的血管系統增加了炎性因子的合成，從而抑制依賴VEGF的膠原合成，延遲傷口的愈合。此外，一系列病理生理因素可導致內皮功能障礙，從而導致血管生成障礙[17]。有學者認為糖尿病在傷口愈合過程中會誘導有缺陷的血管生成反應，VEGF可與Ang-1/Tie-2相互作用通過誘導小管形成、內皮細胞存活和血管退化在血管生成中發揮重要作用[18]。EGF是由血小板、巨噬細胞、成纖維細胞和骨髓間充質干細胞分泌，其可激活內皮細胞增殖、遷移及層粘連蛋白的沉積[19]。而bFGF是一種有效的促分裂原，因其可誘導成纖維細胞的增殖能力而被命名，bFGF的一種糖蛋白可促進血管再生，下調膠原Ⅰ和彈性蛋白表達，并上調皮膚成纖維細胞中的透明質酸合成來促進傷口愈合[20]。研究顯示EGF和bFGF在慢性潰瘍創面中水平降低，EGF和bFGF水平的上調可以促進潰瘍創面細胞增殖進而加速創面愈合[21]。此外，細胞間黏附分子在調節皮膚再生性修復過程中起關鍵調節作用，E-cadherin可與β-catenin相互作用參與傳導核內信號影響細胞的黏附性調節，同時參與角化形成細胞的黏著和成熟化，提示其可能參與調控創傷愈合再上皮化過程[22]。本研究結果顯示，腹腔注射STZ可顯著下調VEGF、EGF、bFGF、E-cadherin的表達，而維格列汀治療明顯提高了VEGF、EGF、bFGF、E-cadherin的表達，進一步證實了維格列汀在促進傷口愈合方面的作用。

4 結論

維格列汀對糖尿病足潰瘍創面愈合具有潛在作用，其通過抑制炎性因子(TNF-α、IL-6)、增加血管再生因子(VEGF、EGF)、再上皮化因子(bFGF、E-cadherin)發揮其潛能，促進創面愈合。但維格列汀對創面愈合的影響具體通過哪些信號通路發揮作用，還有待后續深入研究。