氯消毒對產ESBLs菌β-內酰胺酶類抗性基因接合轉移的抑制作用

張崇淼,牛治瑤,王 真,李永強,梁 杰

氯消毒對產ESBLs菌β-內酰胺酶類抗性基因接合轉移的抑制作用

張崇淼*,牛治瑤,王 真,李永強,梁 杰

(西安建筑科技大學環境與市政工程學院,西北水資源與環境生態教育部重點實驗室,陜西省環境工程重點實驗室,陜西 西安 710055)

以產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的大腸桿菌T413和NK5449分別作為供體菌和受體菌進行接合試驗,研究氯消毒處理供體菌對β-內酰胺酶類抗性基因接合轉移的抑制作用.結果表明,供體菌質粒上的CTX-M和TEM基因可接合轉移至受體菌,接合轉移頻率為6.57×10-2.當氯消毒接觸時間為30min,有效氯濃度在0.25～1.5mg/L時,接合轉移頻率未出現數量級的降低,而有效氯濃度為2mg/L時,接合轉移頻率則驟降至2.02×10-5.在值為60 (mg·min)/L的各種組合中,4mg/L×15min對接合轉移的抑制效果最佳.氯消毒后的供體菌數量與接合轉移頻率呈正相關.經高劑量氯消毒后的供體菌具有較高的再生長率,但接合轉移頻率卻很低.高劑量氯消毒會損傷供體菌菌體結構和功能,使胞外分泌物減少,阻礙質粒傳遞.

氯消毒；超廣譜β-內酰胺酶；β-內酰胺酶類抗性基因；質粒介導；接合轉移

超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是指一類能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環β-內酰胺類抗生素的酶.產ESBLs菌的出現使很多抗生素失去了療效,給人類健康造成了巨大的威脅[1-2].大量研究表明,產ESBLs菌已不僅僅局限于醫院內,在污水[3-5]、河流[6]、湖泊[7]等多種水環境中都發現了它們的蹤跡.隨著污水再生利用的日益廣泛,城市地表水環境可能成為耐藥菌和耐藥基因的“匯”和“源”[8-9],產ESBLs菌的介水傳播是社會公眾不得不面對的嚴峻問題.

根據ESBLs的編碼基因,可以將ESBLs分為TEM族、SHV族、CTX-M族和OXA族[10].隨著研究的深入,一些不屬于上述任何家族的新型ESBLs(例如VEB、PER、GES等)也逐漸被發現[11-12].這些β-內酰胺酶基因位于產ESBLs菌的質粒上[13],很容易在同種或異種細菌之間發生水平轉移(HGT).通過供體菌和受體菌的接合,則是耐藥基因主要的水平轉移方式[14-15].

氯消毒對微生物殺滅作用快、持久性強,是應用最普遍的污水消毒技術之一[16].然而,近年來多項研究都對氯消毒消除耐藥菌和耐藥基因的能力提出了質疑.研究發現城市污水處理廠氯消毒出水中的多重耐藥性沙門氏菌的比例顯著升高[17];氯消毒后的污水中胞外耐藥基因豐度提高了3.8倍,胞內耐藥基因豐度提高了7.8倍[18];銅綠假單胞菌暴露于4mg/L的次氯酸鈉后對頭孢他啶、氯霉素、氨芐西林的耐藥性提高1.4～5.6倍[19].氯消毒能有效殺滅大部分細菌,但并不能完全降解耐藥基因,反而可能造成細菌體內耐藥基因的釋放.從控制細菌耐藥性傳播的角度上看,抑制耐藥基因水平轉移比單純考慮滅活耐藥菌更有意義.然而,迄今為止這方面鮮有研究報道.氯消毒究竟對耐藥基因水平轉移產生何種影響尚不明確.

鑒于此,本文利用從城市地表水中分離出的一株產ESBLs大腸桿菌作為對象,通過研究經過不同氯消毒處理后的供體菌,其耐藥基因的接合轉移頻率的變化,以及接合子的性狀分析,來揭示氯處理對產ESBLs菌的β內酰胺酶類基因接合轉移的影響,為控制抗生素抗性傳播提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 供體菌和受體菌的選擇與培養

使用1株分離自城市地表水體的大腸桿菌T413作為供體菌,經雙紙片協同試驗鑒定為產ESBLs菌,含質粒,對頭孢噻肟耐藥.使用大腸桿菌NK5449作為受體菌,該菌無質粒,對萘啶酸和利福平耐藥.分別使用含有4μg/mL頭孢噻肟的LB液體培養基,含有100μg/mL萘啶酸和300μg/mL利福平的LB液體培養基培養供體菌和受體菌.在37℃, 150r/min過夜培養,使細菌濃度達到約109CFU/ mL.4000r/min離心6min,用PBS緩沖液重懸沉淀,稀釋至108CFU/mL,備用.

1.2 接合實驗

取受體菌懸液1mL,4000r/min離心6min,得到菌體沉淀.用1mL LB液體培養基重懸受體菌沉淀,并與同樣方法制得的供體菌沉淀混合,充分混勻,置于37℃培養箱中接合24h.

將混合菌液進行梯度稀釋,分別取100μL涂布于受體菌篩選平板(含有100μg/mL萘啶酸和300μg/mL利福平的營養瓊脂平板)和接合子篩選平板(含有4μg/mL頭孢噻肟、100μg/mL萘啶酸和300μg/mL利福平的營養瓊脂平板),37℃倒置培養24h后分別計數受體菌和接合子的數量.按式(1)計算接合轉移頻率().

式中:為混合菌液中接合子的數量,CFU/mL;為混合菌液中受菌體的數量,CFU/mL.

1.3 耐藥表型及耐藥基因的檢測

使用K-B紙片擴散法分別對供體菌,受體菌以及接合子進行藥敏試驗,準確測量氨芐西林(AMP,10μg/片)、四環素(TET,30μg/片)、磺胺甲惡唑(SMZ,300μg/片)、環丙沙星(CIP,5μg/片)和頭孢噻肟(CTX,30μg/片)所產生的抑菌環直徑,以大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌株,根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)標準[20]進行耐藥性判定.

表1 β-內酰胺酶類抗性基因和I型整合子的引物序列及擴增產物長度

使用質粒提取試劑盒(Spin Columns,TIANGEN)分別提取供體菌及接合子質粒,利用PCR測定5種主要的β-內酰胺酶類抗性基因(CTX-M、TEM、SHV、VEB、GES)和I型整合子整合酶基因(I1),所使用的引物如表1所示.PCR反應體系為:10′buffer(Mg2+)2.5μL,dNTPs(10mmol/L)2.0μL,10mmol/L上下游引物各1.0μL,5UTaq mix 0.2μL, ddH2O 16.3μL,模板2μL.β-內酰胺酶類抗性基因PCR擴增條件為:94℃預變性5min,95℃變性30s, 52℃退火45s,72℃延伸1min,35個循環;72℃延伸10min.I型整合子PCR擴增條件為: 94℃預變性3min,94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸30s,44個循環;72℃延伸5min.

取5μL PCR產物在110V電壓、1.5%瓊脂糖凝膠濃度條件下進行核酸水平電泳.使用凝膠成像儀(GelDocXR+,Bio-Rad)拍照記錄電泳結果,確定特異性擴增片段.

1.4 氯消毒實驗

取30mL供體菌懸液置于無菌的血清瓶中,使用300r/min的磁力攪拌保證菌懸液始終均勻.加入一定量的次氯酸鈉溶液,使有效氯終濃度分別為0.25mg/L, 0.5mg/L, 0.75mg/L, 1mg/L, 1.5mg/L, 2mg/L, 2.5mg/L, 5mg/L, 10mg/L,接觸反應30min后,加入過量的1.5%硫代硫酸鈉溶液終止反應.不投加次氯酸鈉溶液的樣品作為空白對照(有效氯終濃度為0).

保持有效氯濃度()和接觸時間()的乘積(值)為60(mg·min)/L,分別在1mg/L×60min,1.5mg/L× 40min,2mg/L×30min,3mg/L×20min,4mg/L×15min,6mg/L×10min等組合方式下處理供體菌懸液.

分別取上述不同條件處理后的供體菌懸液1mL進行接合實驗,計算接合轉移頻率.

將使用氯消毒處理后供體菌與未經氯消毒處理后的供體菌分別進行接合實驗,比較接合轉移頻率.按式(2)計算氯消毒對接合轉移頻率的對數抑制率().