高效液相色譜法測定中藥制劑葛根湯顆粒中葛根素含量的研究

游貴君 姜建偉 陳 碧

1.福建省三明市食品藥品審評與不良反應監測中心，福建三明365000；2.福建省三明市檢驗檢測中心，福建三明365000

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，多年生落葉，藤本葛根湯是經典中藥古方制劑，出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治》[1]，被收錄于藥典，由葛根、麻黃、桂枝、白芍、甘草、生姜、紅棗共7味藥組成[2]，其中葛根為君藥，利用葛根湯的傳統配方制備成的葛根湯顆粒[3]，功能為發汗解表、升津舒經[4]，臨床上主要用于發熱鼻塞、惡寒、流涕、咳嗽咳痰、痰淡白稀薄、咽癢、出汗、頭痛、全身酸痛、項背強急、口渴、泄瀉等癥[5]。葛根素為葛根中主要的化學和功效成分之一，其化學名稱為4，7-二羥基-8-β-D葡萄糖基異黃酮，相對分子質量是416，性狀為白色針狀結晶[6-7]，有豐富而廣泛的藥理活性，也是葛根湯顆粒質量控制的一項重要指標。近年來，測定葛根素含量的方法主要有分光光度法及高效液相色譜法[8]，分光光度法（spectrophotometry，UV）的特點是當化合物組分簡單時可作為一種比較常用簡單快速測定葛根素的方法，但當樣品成分構成較多且復雜時，若沒有精準去除干擾將葛根素分離出來，測定結果常常受其他組分的影響。高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC），通過選擇適宜的流動相使樣品中各組分達到有效分離，經紫外檢測器讀取峰面積，使用外標法進行含量計算，HPLC具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點，本研究使用該方法進行葛根湯顆粒中葛根素的含量測定，方法具有操作簡單，特異性高，快速檢測等優點，并進行方法學考察研究，進一步驗證該方法的準確性、有效性、重現性，是對葛根湯顆粒進行質量控制的有效可靠的方法[9-10]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

實驗材料：葛根湯顆粒（樣品）由瑞陽制藥 有 限 公 司 提 供（批 號：19051321、20020121、20022021）；葛根素標準品，購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110752-201816），純度≥ 95%；0.45μm濾膜購自山東西美生物技術有限公司；甲醇、無水乙醇、36%乙酸（國藥集團化學試劑有限公 司，批 號：20190628、20190506、20190617）、純化水。

實驗儀器：安捷倫1260高效液相色譜儀（四元泵、配置DAD檢測器），電子天平（Secura225D-1CN）廠家為賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，超聲波清洗器（KQ3200DE）廠家為昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

本研究考察的指標：線性實驗、重復性實驗、穩定性實驗、耐用性實驗、回收率實驗等方法學考察及三批葛根湯顆粒樣品含量測定。

1.2.1 標準溶液的制備 精密稱取葛根素標準品，以30%乙醇溶解，定容至10 ml，混勻，制成每毫升含有2 mg葛根素的儲備液。分別吸取葛根素標準液，配制成 5、10、20、30、40、50 μg/ml的系列標準液，以供液相色譜分析。

1.2.2 樣品溶液的制備 將樣品（葛根湯顆粒）研磨至細粉并混勻，稱取細粉約0.5 g，精密稱定。將稱取后樣品小心倒入具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 30%乙醇，用蓋密塞，稱重并記錄，將帶樣品的錐形瓶放入超聲中進行超聲處理30 min，取出后放置至室溫，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，振蕩搖勻后離心5 min（4000 r/min）。精密量取上清液5 ml，放置于100 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，振蕩搖勻，供液相分析。

1.2.3 測定 將標準品溶液、樣品溶液和陰性溶液分別過0.45 μm濾膜后待液相色譜分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SBAq C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-36%乙酸-水（25∶3∶72）；流速：0.6 ml/min；波長：247 nm；柱溫：30℃ ；進樣量：10 μl。

1.2.5 計算 葛根湯顆粒中葛根素含量計算公式如下：

式中：X-試樣中葛根素的含量（mg/g）；A1-試樣中葛根素的峰面積；A2-標準液中葛根素的峰面積；C-標準液的質量濃度濃度（μg/ml）；V1-試樣初始定容體積（ml）；V2-上清液體積（ml）；V3-進樣前試樣定容體積（ml）；m-試樣質量（g）。

1.2.6 線性關系考察 取標準液進行液相色譜分析。線性的標準曲線以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行繪制，得線性標準曲線方程為：y=0.4019x+0.3518，R2=0.9997，證明葛根素在5.31～50.59 μg/ml濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。見圖1。

圖1 葛根素線性關系圖

1.2.7 重復性實驗 取樣品，按1.2.2項下方法制備6份樣品溶液，并按1.2.4項下所列的色譜條件進行測定分析。

1.2.8 回收率實驗 稱取9份樣品（含量為6.92 mg/100 g），每份約 0.25 g，精密稱定，按順序編號并分為3組：1～3、4～6、7～9，按組分別精密加入3 種濃度對照品溶液 1 ml（1.40、1.70、2.08 mg/ml），按1.2.2項下所列方法進行含量測定，并計算回收率。結果見表3。

1.2.9 三批樣品含量測定 取三批葛根湯顆粒樣品，依據《中華人民共和國藥典（一部）》[2]按1.2.2項下方法進行樣品制備，按照1.2.4項下色譜條件進行測定分析。結果見表4。

2 結果

2.1 樣品重復性實驗結果

實驗結果表明：應用本方法測定葛根素含量，重復性較好。見表1。

表1 樣品重復性實驗結果

2.2 耐用性實驗

分別考察樣品中葛根素含量在不同流速（0.6、0.8、1.0 ml/min）、不同柱溫（25、30、35℃）及不同色譜柱條件下的含量變化。結果顯示RSD分別為0.95%、0.63%、1.21%，表明應用本方法測定葛根素含量，方法耐用性較好。

2.3 穩定性實驗

實驗結果表明，應用本方法測定葛根素的含量，該方法中樣品溶液峰面積在24 h內變化不大，證明穩定性良好。見表2。

表2 樣品溶液的穩定性實驗結果

2.4 回收率實驗

實驗結果表明：樣品的平均回收率為97.16%，RSD=0.90%，此方法準確可行。見表3。

表3 回收率實驗測定結果

2.5 三批樣品含量測定

實驗結果表明，三批樣品含量測定平均值是（6.90±0.01）mg/g，高于現行最低含量要求，批內與批間差異均不大。見表4。

表4 三批樣品葛根素含量測定結果

3 討論

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根湯為中醫的傳統經典古方[11]，以葛根為君藥，佐以麻黃、桂枝、白芍、甘草、生姜、紅棗等中藥配伍，按照現代制劑工藝制成葛根湯顆粒，從古至今，葛根湯被廣泛應用，主治外感風寒、無汗畏風等癥狀[12]?，F代實驗研究證明葛根湯對抗炎、鎮痛、活血及抑菌等方面有較好的作用[13]。葛根素為葛根中主要化學成分之一，也是葛根湯顆粒中主要功效成分[14]，因此，測定葛根湯顆粒中葛根素的含量，對其質量標準的建立具有積極的意義。

本研究應用高效液相色譜法對葛根湯顆粒中葛根素進行方法學研究及含量測定，實驗結果為：葛根素在5.31～50.59 μg/ml濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為y=0.4019x+0.3518，R2=0.9997；重復性實驗平均值為6.92 mg/g，RSD為0.97%，證明該方法重復性較好；穩定性實驗考察24 h樣品含量變化，RSD為0.68%，表明穩定性良好；耐用性實驗分別進行不同流速、不同柱溫、不同色譜柱條件下葛根素含量的考察，RSD分別為0.95%、0.63%、1.21%，耐用性良好?；厥章蕦嶒灧謩e考察低、中、高三組不同對照品加入量，回收率的平均值為97.16%，RSD為0.90%，表明回收率良好?？疾烊鷺悠?，每批5個平行試樣，結果表明三批樣品含量測定平均值是（6.90±0.01）mg/g，批內與批間差異均不大。

本研究在實驗過程中應注意控制樣品處理的時間、溫度等可能影響實驗結果的細節操作，葛根素具有廣闊的市場前景，可創造一定的經濟價值，綜上所述，應用HPLC進行葛根湯顆粒中葛根素的含量測定，該方法準確性高，可靠性好，適用于葛根湯顆粒質量標準的建立。

隨著現代醫學的不斷發展，臨床上越來越多的開展了中醫經典方劑的應用，葛根湯作為其中較為典型的一個經方，其組方配伍適宜，用量得當[15]，被現代醫學應用于較多系統疾病的治療中，因此其質量標準的建立尤為重要，把好質量關，為葛根湯廣泛應用于臨床治療提供依據。