免疫球蛋白G4熒光免疫層析定量檢測試劑的研制及性能評價

楊曉妍 張樂之 賀琤雯

1海軍軍醫大學第一附屬醫院體檢中心，上海 200433；2海軍軍醫大學第一附屬醫院實驗診斷科，上海 200433

IgG4相關性疾病(immunoglobulin G4-related disease，IgG4-RD)是一種原因不明的慢性自身免疫介導的炎癥性、纖維化性疾病，可累及全身多個器官和系統。2001年Hamano等[1]首次報道硬化性胰腺炎患者血清IgG4濃度升高。孫林等[2]報道血清IgG4對自身免疫性胰腺炎(autoimmune pancreatitis，AIP)與慢性胰腺炎、胰腺癌的鑒別診斷具有重要價值。近年來IgG4作為AIP早期診斷、療效檢測和預測復發的指標，在AIP診治方面起到了重要的作用[3]。目前定量檢測IgG4的方法主要有酶聯免疫吸附法[4]、免疫散射比濁法[5]。酶聯免疫吸附法靈敏、特異，但需多次洗滌和孵育，操作繁瑣，且定量測定結果不穩定。免疫散射比濁法具有精確、簡便、可重復性強等優點，但脂血或溶血樣本會干擾IgG亞類的檢測，且成本較高。本研究建立了一種適用于即時檢驗(point of care testing，POCT)的熒光標記技術與免疫層析技術相結合的快速定量檢測方法，適用于門急診批量樣本的定量檢測。

材料與方法

一、材料

收集海軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科經全自動蛋白分析儀BNⅡ系統測定過IgG4濃度的383例臨床血清樣本，其中胰腺炎相關疾病115例，其他疾病268例。杭州康知生物科技有限公司提供的200例健康人(年齡均>18歲，男女比例各50%)血清樣本IgG濃度作為正常參考值。

鼠抗IgG4單克隆抗體、IgG4參考品及熒光微球由杭州康知生物科技有限公司提供。干式熒光免疫分析儀由蘇州和邁精密儀器有限公司生產。硝酸纖維素膜(NC膜)購自德國Sartorius Stedim公司。全自動蛋白分析儀BNⅡ系統和IgG4測定試劑盒(免疫散射比濁法)購自西門子醫學診斷產品(上海)有限公司。

二、方法

1．熒光免疫層析法檢測IgG4的原理：將免疫層析法與熒光定量技術相結合，采用競爭法反應模式，以鼠抗人IgG4單克隆抗體標記在時間分辨熒光微球上作為檢測抗體，NC膜的檢測線(T線)包被大腸桿菌表達的IgG4抗原，質控線(C線)包被羊抗鼠IgG，將樣本與熒光微球均勻混合，通過層析方法檢測。若樣本中含有IgG4，首先與熒光微球上標記的IgG4抗體相結合，再與C線上的羊抗鼠IgG形成免疫復合物；若樣本中不含IgG4，則熒光微球上標記的IgG4抗體與T線上的IgG4抗原形成免疫復合物。T線和C線上的熒光信號比值(T/C值)與待測樣本的IgG4含量呈反比。根據IgG4標準曲線計算待測樣本的IgG4含量。

2．熒光免疫層析試劑盒的制備：(1)檢測卡制備。用包被緩沖液分別將IgG4抗原和羊抗鼠IgG抗體稀釋至0.2 mg/ml，噴涂到NC膜上相對應的T線和C線，45℃過夜烘干。底板上依次粘貼樣品墊、NC膜和吸水紙，組裝成檢測卡(圖1)，4～30℃保存備用。(2)鼠抗人IgG4單抗標記的熒光微球制備。將熒光微球溶解于硼酸緩沖液，加入適量碳化二亞胺(1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺，EDC)，室溫活化15 min，加鼠抗人IgG4單抗，室溫震蕩標記2 h，然后加入封閉液封閉1 h后離心，按(100～200)∶1比例用硼酸緩沖液重懸鼠抗人IgG4單抗標記的熒光微球，置2～8℃保存備用。(3)IgG4標準曲線ID卡。測試9.87、5.20、2.72、1.20、0 g/L IgG4標準品的熒光信號均值，輸入干式熒光免疫分析儀軟件，四參數logistic擬合標準曲線，制備ID卡。

圖1 檢測卡組成

3．熒光免疫層析法的性能評價：(1)線性范圍。參考《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》，取高濃度樣本(接近10 g/L)、低濃度樣本(樣本稀釋液)各一份，依次按照10/10、8/10、4/10、2/10、1/10、1/20、1/50稀釋，重復測定3次，計算每點均值作為Y軸，以理論濃度值為X軸，做散點圖并進行直線回歸分析。(2)精密度與準確度。分別對濃度為1.20 g/L和2.65 g/L的IgG4標準品進行檢測，每個濃度測試10次，取均值，計算各濃度變異系數(coefficient of variation, CV)和準確度偏差。(3)干擾試驗。選擇臨界值附近的血清樣本，分別配制含0、0.5、1.25、2.5、3、5 g/L的膽紅素樣本，含0、2、5、10、30、35 g/L的三酰甘油樣本，含0、2、5、10、12、15 g/L的血紅蛋白樣本，每個濃度樣本測試3次，取均值，計算均值與0濃度組的偏差，偏差在±15%范圍內為本產品可接受的干擾物濃度。(4)穩定性試驗。將成品置于2～8℃冷庫保存，分別于第1、3、6、9、11、12、13、14個月測試濃度為1.20 g/L和2.65 g/L的IgG4標準品，每個濃度測試3次，取均值，計算均值與理論濃度的偏差，偏差在±15%以內為試劑穩定性良好。(5)正常參考值試驗。應用熒光免疫層析試劑盒檢測200例健康人血清樣本的IgG4濃度，確定IgG值的正常參考范圍。(6)臨床應用驗證。應用熒光免疫層析試劑盒檢測383例臨床血清樣本的IgG4濃度，并與西門子IgG4測定試劑盒(免疫散射比濁法)檢測值比較，評價兩種方法的一致性。

三、統計學處理

結 果

一、熒光免疫層析法定量檢測IgG4的線性范圍和標準曲線

分析結果顯示，理論值與實測值相關性良好，在樣本濃度(0.2～10)g/L范圍內，回歸方程為Y=1.0841X-0.379，相關系數R2=0.9970，結果呈線性(圖2)。熒光免疫層析法定量檢測IgG4的熒光信號T/C值與IgG4參考品濃度呈平滑遞減曲線(圖3)，回歸方程為Y=(0.96339+0.02874)/[1+(X/1.97249)0.99397]-0.02874，R2=0.99935，擬合度較高。

圖2 不同濃度IgG4實測值與理論值回歸圖

圖3 熒光免疫層析法測定IgG4的標準曲線

二、熒光免疫層析法定量檢測IgG4的精密度與準確度

對濃度為1.20 g/L IgG4的標準進行檢測，結果為(1.31±0.09)g/L，CV為7.2%，準確度偏差為8.8%；對濃度為2.65 g/L IgG4標準品進行檢測，結果為(2.84±0.16)g/L，CV為5.6%，準確度偏差為7.2%。各檢測濃度的CV均<15%，準確度偏差均在±15%以內，熒光免疫層析法精密度和準確度高，臨床可接受。

三、熒光免疫層析法定量檢測IgG4的抗干擾能力

不同濃度干擾樣本與0濃度組檢測偏差見表1，當樣本中的血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素的濃度分別為10、10、2.5 g/L時，測試結果偏差均在±15%以內，不會對結果產生明顯干擾，說明熒光免疫層析法抗干擾能力強。

表1 熒光免疫層析法定量檢測IgG4的抗干擾性

四、熒光免疫層析法定量檢測IgG4的穩定性

14個月內檢測濃度為1.20、2.65 g/L的IgG4標準品，各濃度偏差均在±15%以內(表2)，表明熒光免疫層析法定量檢測IgG4較穩定，故試劑盒有效期定為12個月。

表2 熒光免疫層析法定量檢測IgG4的穩定性

五、熒光免疫層析法定量檢測IgG4的正常參考值

表3 200例健康人血清IgG4濃度頻數分布

六、熒光免疫層析定量檢測IgG4的臨床應用驗證

西門子BNⅡ系統IgG4測定試劑盒(散射比濁法)檢測結果顯示，383例血清樣本中56例IgG4≤0.20 g/L，249例為0.20～2.03 g/L，74例為2.03～10 g/L，4例>10 g/L。熒光免疫層析定量檢測試劑盒檢測結果顯示，383例血清樣本中42例IgG4≤0.20 g/L，267例為0.20～2.03 g/L，71例為2.03～10 g/L，3例>10 g/L。兩組數據有顯著相關性(圖4)，線性回歸方差為Y=0.9924X-0.0240，R2=0.9880，P<0.05，方程斜率的95%CI為0.9814～1.0034，截距的95%CI為-0.0776～0.0297。經秩和檢驗，兩種檢測方法的結果偏差無統計學意義(Z=-0.7141，P=0.4752)，具有很好的一致性。

熒光免疫層析法定量檢測的IgG4值的ROC曲線分析見圖5，AUC值為0.992，95%CI為0.953～1.000，計算獲得的臨界值為2.01 g/L，診斷胰腺炎相關疾病的靈敏度為96.3%，特異度為95.5%。

圖4 熒光免疫層析法與免疫散射比法檢測IgG4結果的相關性

圖5 熒光免疫層析法定量檢測胰腺炎相關疾病IgG4的ROC曲線

討 論

AIP是一種自身免疫介導的胰腺慢性炎癥，是慢性胰腺炎的特殊類型，目前發病機制尚不清楚。作為全新的臨床疾病獨立分型，AIP正受到越來越多的關注，其早期診斷與治療、預測復發與判斷預后及提高診治水平已成為目前研究的重點。目前AIP的診斷標準主要有日本胰腺協會(JPS)2006年修改后標準[6]、韓國2006年Kim標 準[7]、美國MayoClinic的2006年HISORt標準[8]和2008年的亞洲標準[9]，以及最近發表的IgG4相關性疾病診治中國專家共識[10]。雖然AIP診治標準不盡相同，但以上各標準中的血清學指標均包括血清 IgG4水平升高，可見血清 IgG4水平升高對 AIP的診斷非常重要。近年來IgG4作為AIP早期診斷、療效檢測和預測復發的指標，為AIP的診治開辟了新的途徑[11]。

本研究建立了一種快速檢測血清IgG4的方法，檢測的線性范圍為0.2～10 g/L，試劑盒在線性范圍內對200例健康人血清IgG4水平進行檢測，通過95百分位法分析，得到健康人血清IgG4的95%CI的上限為2.03 g/L。臨床驗證結果證實，該試劑盒與西門子BNⅡ系統免疫球蛋白G4測定試劑盒(散射比濁法)具有良好的相關性(R2=0.9880)，兩種檢測方法結果偏差無統計學意義，具有一致性。通過ROC曲線分析，以2.01 g/L為臨界值，該試劑盒診斷胰腺炎相關疾病的靈敏度為96.3%，特異度為95.5%。

目前，血清IgG4含量檢測的方法主要有放射免疫擴散法、酶聯免疫吸附法、散射比濁法。本研究采用熒光免疫層析法，是將抗體使用熒光標記物進行標記，通過免疫層析的方法使標記抗體和待測物在膜上通過毛細管作用進行層析。 該方法是一種微量分析方法，根據熒光強度，對物質進行定量分析，具有高靈敏度、選擇性強、需要樣本量少及操作簡便等優點；還具有試劑以及儀器方便攜帶、試劑穩定性好、操作簡單不需要專職人員操作、可以進行臨床實時檢測服務的特點。

與現有同類產品相比，本研究所建立的的IgG4熒光免疫層析定量檢測方法為國內首創，具有良好的精密度和準確度，不受血清血紅蛋白、三酰甘油和膽紅素等干擾物質的影響，試劑盒12個月內有效；檢測的靈敏度和特異度高達96.3%及95.5%，重復性和穩定性好，與散射比濁法具有良好的相關性(R2=0.9880)；僅需20 μl抗凝血漿樣本，樣本隨到隨檢，儀器測試時間<5 s，整個檢測流程短，15 min即可出報告；有3種適用的輕便機型，設備便攜，可采用單機或PC聯機工作模式，儀器接口多樣，支持醫院LIS系統連接功能，操作簡便；試劑盒內配的ID卡可存儲標準曲線，實現精準定量，因此適用于各大醫院門急診檢驗科和基層醫院等應用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突