長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1靶向miR-330促進胰腺癌細胞吉西他濱耐藥作用

李銳 祝喜萍 宋蕾

黑龍江省醫院消化病院消化三科，哈爾濱 150086

化療耐藥是導致胰腺癌高病死率的重要原因之一[1-2]。隨著化療藥物的長期使用，機體自身的免疫系統產生耐藥性，化療藥物對于腫瘤細胞的殺滅力度明顯降低，影響患者的生存時間[3]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一種長度大于200nt的非編碼RNA，主要通過內源性競爭RNA的作用方式參與多種疾病的病理生理過程。小核仁RNA宿主基因(small nucleolar RNA host genes，SNHGs)是lncRNA的一個亞群，有報道其成員SNHG1、SNHG 6異常表達參與多種腫瘤細胞生物學過程[4-7]。miR-330是SNHG1的下游靶基因之一，現有的研究表明miR-330在膠質瘤[8]、結直腸癌[9]以及肺癌[10]等癌細胞中低表達。吉西他濱(gemcitabine, GEM)為胰腺癌的一線化療藥物[11-13]，目前關于SNHG1和miR-330在胰腺癌GEM耐藥中的作用未見報道。本研究探討SNHG1對胰腺癌GEM耐藥細胞增殖活性以及侵襲遷移能力的影響，驗證SNHG1與miR-330的靶向關系，闡明SNHG1/miR-330信號軸在胰腺癌GEM耐藥中的作用。

資料與方法

一、胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織lncRNA SNHG1和miR-330表達檢測

收集癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)胰腺癌數據集的179例胰腺癌組織和171例癌旁正常胰腺組織的臨床數據，通過GEOtoR軟件分析胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織lncRNA SNHG1和miR-330的表達。

二、GEM耐藥的胰腺癌PANC1細胞株的構建

人胰腺癌PANC1細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，常規復蘇、傳代。體外采用間歇梯度倍增法[14]用GEM刺激PANC1細胞24周，建立GEM耐藥PANC1細胞株(耐藥株)。預實驗結果顯示100 μmol/L的GEM刺激效果最佳，故以下實驗均采用100 μmol/L的GEM刺激獲得耐藥細胞。

取PANC1耐藥細胞，使用Lipofectamine 3000(Life Technologies，美國)分別將陰性對照siRNA(si-NC)、靶向lncRNA SNHG1的siRNA(si-SNHG1)轉染耐藥細胞，并運用Geneticin(Sigma-Aldrich，美國)進行篩選，建立穩定的si-NC耐藥株、si-SNHG1耐藥株及單純耐藥株。此外，為了驗證SNHG1對miR-330的調控作用，分別將陰性對照抑制劑(NC-inhibitor，NC-inh)和si-NC、NC-inh和si-SNHG1、miR-330-inh和si-SNHG1共同轉染耐藥細胞，建立了穩定的NC-inh+si-NC耐藥株、NC-inh+si-SNHG1耐藥株及miR-330-inh+si-SNHG1耐藥株。所有的miRNA、siRNA以及陰性對照均購自廣州銳博生物技術有限公司。

三、GEM耐藥PANC1細胞的lncRNA SNHG1和miR-330表達檢測

取3組對數生長期PANC1耐藥細胞，采用TRIzol(Life Technologies，美國)法提取細胞總RNA，運用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa，日本)將總RNA逆轉錄成cDNA，上Bio-Rad-CFX-qRT-PCR檢測系統(Applied Biosystems Inc.，美國)，使用SYBR Green Master(ROX；Roche，加拿大)進行實時熒光定量PCR反應。SNHG1 正向引物序列為5′-TGCAATGTTCAGCCCACAAG-3′，反向引物序列為5′-GCA-GCTGAATTCCCCAGGATA-3′；miR-330 正向引物序列為5′-TCTCTGGGCCTGTGTCTTAG-3′，反向引物序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，內參U6正向引物序列為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物序列為5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′；內參GAPDH正向引物序列為5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′，反向引物序列為5′-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。通過儀器自帶軟件獲取擴增產物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt計算其相對表達量，每個樣品設3個復管，取均值。

四、GEM耐藥PANC1細胞增殖活性檢測

選用3～6代si-NC耐藥組、si-SNHG1耐藥組、單純耐藥組、NC inh+si-NC耐藥組、NC inh+si-SNHG1耐藥組以及miR-330 inh+si-SNHG1耐藥組的對數生長期PANC1細胞，以每孔2×103個細胞種植于96孔板，加入GEM(100 μmol/L)孵育48 h，各孔加入10 μl CCK-8染料(中國碧云天公司)，置37℃繼續孵育4 h，上酶標儀測量波長450 nm處每孔的吸光度值(A450值)。

取各組1×106個細胞，均勻鋪在含有無菌玻片的6孔板中，加入GEM(100 μmol/L)繼續孵育48 h，4%甲醛固定30 min，隨后加入Ki67抗體(沈陽萬類生物有限公司)，按照免疫熒光操作流程進行熒光染色，置熒光顯微鏡下(40倍)觀察細胞熒光，用Imagej軟件定量細胞內Ki67的熒光強度。

五、GEM耐藥PANC1細胞侵襲能力檢測

采用Transwell小室檢測細胞的侵襲能力。Transwell小室隔膜上表面加50 μl基質凝膠過夜。取上述各組對數生長期PANC1細胞，調整細胞密度為1×105/ml，Transwell上室加100 μl細胞懸液，下室加500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液，培養48 h后取出小室的隔膜，用棉簽輕輕擦去未穿膜細胞，乙醇固定隔膜5 min，1%的結晶紫染色30 min，置倒置相差顯微鏡下隨機取5個200倍視野計數穿膜細胞數。每組做6個Transwell小室，取均值。

六、GEM耐藥PANC1細胞遷移能力檢測

采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。將各組1×106個/ml細胞接種到6孔板，培養過夜形成單層細胞時，使用10 μl的槍頭垂直于孔板底部劃3條直線，間隔0.5 cm，用PBS洗滌3次，加入無血清培養基培養24 h，置倒置相差顯微鏡下對劃痕前后的相應區域拍照。每組設3個復孔，重復3次。使用Image J軟件計算各組細胞遷移24 h后的遷移距離。

七、lncRNA SNHG1與miR-330的靶向關系驗證

通過Starbase 3.0數據庫搜索lncRNA SNHG1的潛在靶基因。生物信息學研究顯示lncRNA SNHG1和miR-330存在13個互補堿基(圖1)，在此基礎上設計野生型lncRNA SNHG1(SNHG1-WT)、突變型lncRNA SNHG1(SNHG1-MT)、野生型miR-330(miR-330-WT)和缺失miR-330的突變型miR-330(miR-330-MT)。熒光素報告酶報告載體購自美國Life Technologies公司。分別將SNHG1-WT、SNHG1-MT、miR-330-WT、miR-330-MT熒光素酶報告載體通過lipofectamine 3000轉染到GEM耐藥的PANC1細胞中。其中， lncRNA SNHG1以及miR-330中野生型與突變型序列分別在結合位點處納入pMIR報告熒光素酶含有SpeI和HindⅢ載體位點(Ambion，USA)。對于未改變結合位點的lncRNA SNHG1以及miR-330指定為SNHG1-WT和miR-330-WT，結合位點改變的lncRNA SNHG1以及miR-330指定為SNHG1-MT和miR-330-MT。然后，將lncRNA SNHG1以及miR-330分別轉染GEM耐藥PANC1細胞24 h，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega，美國)檢測熒光素酶活性。

圖1 lncRNA SNHG1與miR-330相互作用的核苷酸結合位點信息

八、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織和各組GEM耐藥PANC1細胞lncRNA SNHG1和miR-330表達水平

胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA SNHG1的表達量分別為6.54±0.72、5.46±0.54，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(t=6.00，P<0.01)。胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織miR-330的表達量分別為2.54±1.85和3.01±1.23，癌組織明顯低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(t=2.73，P<0.05)。

si-NC耐藥組、si-SNHG1耐藥組、單純耐藥組細胞的lncRNA SNHG1表達量分別為2.43±0.10、0.26±0.08、3.25±0.31，si-SNHG1耐藥組顯著低于其他兩組(t=1.21，P<0.05)，表明抑制lncRNA SNHG1表達的耐藥細胞株構建成功。si-NC耐藥組、si-SNHG1耐藥組、單純耐藥組細胞miR-330的表達量分別為0.47±0.13、1.84±0.12、0.38±0.21，si-SNHG1耐藥組顯著高于其他兩組，提示抑制SNHG1表達能上調耐藥細胞miR-330的表達。

二、抑制SNHG1表達對GEM耐藥PANC1細胞增殖活性及侵襲、遷移能力的影響

與si-NC耐藥組、單純耐藥組比較，si-SNHG1耐藥組細胞A450值、Ki67熒光強度、穿膜細胞數、遷移距離均顯著降低，差異均有統計學意義，而si-NC耐藥組與單純耐藥組細胞的上述指標差異均無統計學意義(圖2，表1)。提示抑制SNHG1表達能夠抑制GEM耐藥PANC1細胞的增殖活性及侵襲、遷移能力。

圖2 單純耐藥組(1)、si-NC耐藥組(2)、si-SNHG1耐藥組(3)細胞Ki67熒光強度

表1 單純耐藥組、si-NC耐藥組及si-SNHG1耐藥組細胞增殖活性、Ki67強度、侵襲及遷移能力的比較

三、lncRNA SNHG1靶向調控miR-330

si-SNHG1耐藥組細胞的miR-330-WT熒光素酶活性較si-NC耐藥組顯著升高(3.21±0.22比1.03±0.18，t=2.976，P<0.05)，而si-SNHG1耐藥組與si-NC耐藥組細胞的miR-330-MT熒光素酶活性的差異無統計學意義(1.03±0.28比0.98±0.24，t=1.47，P>0.05)；miR-330-inh耐藥組細胞的SNHG1-WT熒光素酶活性顯著低于NC-inh耐藥組(0.97±0.21比2.32±0.17，t=2.14，P<0.05)，而miR-330-inh耐藥組與NC-inh耐藥組細胞的SNHG1-MT熒光素酶活性的差異無統計學意義(0.99±0.14比1.05±0.14，t=1.01，P>0.05)，提示lncRNA SNHG1和miR-330之間可以靶向結合。

四、抑制miR-330表達可逆轉si-SNHG1對GEM耐藥PANC1細胞抑制增殖以及侵襲遷移的作用

NC-inh+si-SNHG1組細胞A450值、Ki67熒光強度、穿膜細胞數、遷移距離較NC-inh+si-NC組均明顯降低，而miR-330-inh+si-SNHG1組較NC-inh+si-SNHG1組均顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表2)，提示抑制miR-330表達能夠逆轉由于SNHG1低表達抑制的GEM耐藥PANC1細胞的增殖活性及侵襲、遷移能力。

表2 NC-inh+si-NC、NC-inh+si-SNHG1組及miR-330-inh+si-SNHG1組的細胞活性、Ki67熒光強度、侵襲及遷移能力比較

討 論

lncRNA是一種“新型”的非編碼RNA，其長度在200～2 000個核苷酸序列。lncRNA并不能編碼蛋白故往往被認為是一種翻譯過程中的“噪音”而未受到重視。然而，現有報道證明lncRNA通過多種作用機制參與腫瘤的惡性進展以及化療藥物耐藥[15]，尤其參與胰腺癌GEM耐藥的作用[16]。lncRNA SNHG1作為原癌基因廣泛參與多種癌癥的病理生理過程，如結直腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌及骨肉瘤等[17]。本研究結果顯示，SNHG1首先在胰腺癌腫瘤組織中高表達，而低表達SNHG1可體外抑制胰腺癌PANC1 GEM耐藥細胞株的細胞增殖活性以及侵襲遷移，這種作用是通過靶向調控SNHG1下游的miR-330實現的。

內源性競爭RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)揭示了一種RNA間相互作用的新機制。ceRNA尤其是在lncRNA參與癌癥細胞化療藥物耐藥中扮演著重要的角色。Liu等[18]研究發現lncRNA HCP5通過吸附miR-214-3p釋放其對于HDGF靶向作用從而調節胰腺癌GEM耐藥性。Xu等[19]證明，lncRNA DLEU2L可以靶向調控miR-210-3p/乳腺癌易感基因2信號軸抑制胰腺癌細胞對GEM的耐藥性。本研究結果發現，在GEM耐藥的PANC1細胞中SNHG1表達明顯升高，抑制SNHG1后GEM耐藥的PANC1細胞增殖活性以及侵襲遷移能力明顯降低。同時，低表達SNHG1后可以靶向調控GEM耐藥PANC1細胞中miR-330的表達。而miR-330往往作為一種抑癌因子以及ceRNA的關鍵作用靶點參與多種癌癥的惡性進展。miR-330作為ceRNA的調控因子參與circHIPK3調控RAS關聯域家族的表達促進胰腺癌細胞對GEM耐藥[20]。本研究結果顯示低表達miR-330能夠使SNHG1-WT的表達升高，而對于SNHG1-MT并未有影響，說明miR-330是SNHG1的靶基因。以上的結果說明SNHG1可靶向調控miR-330的表達，參與胰腺癌細胞的GEM耐藥。

GEM耐藥PANC1細胞共轉染si-SNHG1以及miR-330 inhibitor可逆轉由si-SNHG1誘導的GEM耐藥PANC1細胞增殖活性以及侵襲能力降低。筆者假設這種作用可能是由于SNHG1靶向結合miR-330后釋放了miR-330對下游因子的吸附作用，增強了SNHG1對于胰腺癌GEM耐藥細胞活性作用，為SNHG1/miR-330信號軸成為胰腺癌GEM耐藥的潛在治療靶點提供理論支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突