干細胞分泌因子應用于骨科-兔骨損傷

王紅戟 杞斯卡娜 保志鵬 王榮平 朱興貴 薛杰

摘要：干細胞分為全能干細胞、多能干細胞、專能干細胞。其中專能干細胞只能在某一特定的組織器官應用中修復一種組織。本次試驗，基于骨干細胞治療骨疾病的應用研究，36只試驗兔子構建動物模型。將試驗兔分為2組進行試驗。其中一個組使用干細胞分泌因子修復液，另一個對照組未使用。結果證明：干細胞分泌因子在相同動物的骨損傷上的應用呈顯著差異性，有修復骨細胞功效。通過本次試驗說明了干細胞分泌因子在骨修復臨床應用上有一定效果。

關鍵詞：干細胞分泌因子、專能干細胞、0.5 ml甲基纖維素凝膠、動物模型

前言

這些成年干細胞已得到廣泛的研究并在醫療上有所應用。蔣桃[1]等人用犬做過研究。蔣桃的試驗方法：采用12只幼年中華田園犬，按幼犬免疫和驅蟲程序進行免疫、驅蟲后進行全面體檢合格后作試驗犬。在每只試驗犬背部作3個30mm*30mm皮膚損傷模型，結論：干細胞分泌因子治療創面愈合速度明顯提高，顯著縮短療程，創面肉芽組織、血管、汗腺、毛囊等生長更好。研究結果表明，采用干細胞分泌因子修復犬皮膚損傷（包括車禍、皮膚病、外科損傷）具有良好效果，能加快修復皮膚速度 。作者采用36只兔隨機分為實驗組和對照組，每組18只，構建動物模型。其中一個組使用干細胞分泌因子修復液，另一個對照組未使用。試驗從干細胞分泌物因子在實驗兔骨損傷的應用，對動物骨病治療方面提供生物制劑治療提供依據。

一、干細胞分泌因子相關內容

（一）干細胞分泌因子的概念：

1、干細胞分泌因子的概念

是指那些未分化的、因而有可能分化成不同類型細胞的細胞，具有自我更新，高度分化的細胞。

2、干細胞分泌因子的來源

2.1干細胞按其功能分化分為全 能干細胞、多能干細胞和專能干細胞。全能干細胞可以形成完整組織器官;多能干細胞可以用于血管，軟組織的修復;專能干細胞是只能形成一種組織。[2]

3、課題研究的目的

成年實驗兔干細胞分泌因子動物模型已得到廣泛研究并為醫療上應用提供依據。本次研究基于專能干細胞的應用。

（二）干細胞分泌因子的研究路徑設想

在寵物臨床診療時，發現寵物在治療組織器官損傷時，骨骼組織的損傷手術過程繁瑣，醫療費用較高，后遺癥嚴重，希望用干細胞修復組織器官能力修復骨骼，動物能夠痊愈，并且減少后遺癥。故采用試驗動物兔子進行試驗。

二、材料方法

1、藥物試劑及設備

500ml生物化學制品*Biological Industries，?1g/支甲基纖維素，10%水合氯醛2 ml，辛伐他汀乙醇。4 ℃冰箱，磁力攪拌器，180升烤箱

2、實驗對象

36只成年雄性新西蘭大耳白兔（體重2-3 kg，動物實驗中心提供），所有實驗兔均在清潔級動物房內飼養[3]，實驗過程對動物的處置符合倫理學標準，本次實驗材料使用的是體外干細胞增殖分化為干細胞分泌因子，沒有殺傷動物的方法試驗，所以符合倫理學標準。

36只兔隨機分為實驗組和對照組，每組18只。其中18只不做處理，作為①對照組;[4]行單側（左上肢）岡上肌肩袖組織撕裂修補術，另外18只作為②實驗組;行單側（左上肢）岡上肌肩袖組織撕裂修補術，同時給予干細胞分泌因子。術后所有兔均按標準條件飼養并分別于術后14天，28天，56天各處死6只兔子，留取手術部位局部標本[5]，進行生物力學檢測和組織學觀察，觀察比較兩種模型愈合過程中的相似程度。對照組不做處理，觀察在相同條件下自然發病的臨床癥狀。使用自己制備的干細胞分泌因子。[5]

3、手術方式

3.1常規飼養7天，開始做動物模型，確認飲食活動正常，用直徑為0.8 mm的克氏針自骨槽內側向肱骨大結節外側皮質鉆兩個骨孔，用絲線縫合穿過骨孔將岡上肌肌腱斷端拉回骨槽[4]。

3.3在打結固定前，實驗組在骨槽內注入 0.5 ml干細胞分泌因子/甲基纖維素凝膠;【4引證】

3.4對照組注入 0.5 ml甲基纖維素凝膠，逐層縫合切口。

4.4西安百奧普生物有限公司進行。干細胞分泌因子修復液由該公司提供。試驗使用在云南昆明某試驗農場完成。

5、檢測方法

5.1實驗標本收集

5.1.1實驗組和對照組兔子于術后第14、28、56天各處死6只，以岡上肌止點為中心，截除近端的肩胛骨和遠端肱骨，僅保留岡上肌腱與近端肱骨，剔除其余軟組織，用浸過生理鹽水的濕紗布包裹后行生物力學測試，測試完畢后，將標本浸泡在10%的中性福爾馬林溶液中，4 ℃冰箱保存。[5]

5.2生物力學測試

將標本同定在Instron 3300電子萬能材料試驗機上進行拉伸試驗，每個標本先以6N的拉力預處理1分鐘，然后以載荷率為5 mm/min行拉斷試驗，測量最大載荷與剛度。

5.3 組織學染色

5.3.1將生物力學測試完的標本置于10%多醛溶液固定24 h后EDTA脫鈣，然后再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，沿腱一骨界面縱軸切片，制成4 μm厚的切片，術后14、28、56天進行HE染色和甲苯胺藍染色，觀察軟骨細胞和成纖維細胞的含量。[6]

5.3.2 HE染色操作。用蠟筆在血膜兩頭畫線，以防染液溢出。然后將血涂片平放在染色架上。[9]用瑞氏染液3～5滴覆蓋整個血膜固定細胞0.5～1 min。滴加等量或稍多的緩沖液，用洗耳球將其與染液吹勻，染色5～10 min。慢慢搖動玻片，然后用流動水從玻片的一側沖去染液，待血涂片自然干燥后（或用濾紙吸干），即可鏡檢。加藍流由天青-伊紅組成，對細胞核著色較好，結構顯示更清[9]。

5.4統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件處理數據，該方法是目前通用的的生物統計方法，數據以均數±標準差（±s）表示，組間差異采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05驗證差異是否有統計學意義。[7]

三、結果

1一般結果

實驗組和對照組中動物在術后出現運動機能障礙，手術側肢體活動失調的情況，其中有一部分兔局部組織感染化膿的現象（感染率約5%）;飲食無明顯變化，體重無明顯變化。

對照組有化膿性滑膜炎，臨床癥狀為跛行，觸摸肩關節腫脹，髖關節不易觸摸。

2對照組實驗室血常規結果表1-2[8]

3對照組臨床檢查?表1-2[8]

4發病原理：

化膿的體溫升高的原因是由炎癥引起的，表現為粘膜充血、水腫和出血，并被覆多量黃白色膿樣分泌物。

5組織切片染色結果

5.1取第56天骨做骨組織切片，同時進行組織切片HE和Masson染色。HE染色觀察：細胞核呈藍色，細胞質呈淡紅色。Masson染色觀察：膠原纖維呈藍色，肌纖維、細胞質、纖維素、角蛋白和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。[10]

5.2實驗結果顯示，術后56天，實驗組肌腱與骨結合緊密，肌腱膠原纖維粗大規則，與正常的腱骨界面結構相似;

5.3對照組腱骨間隙模糊，膠原纖維連接紊亂。

5.4生物力學檢測結果，如下表

四、結論：

1、通過本次試驗證明干細胞分泌因子在相同動物的骨損傷上的應用呈顯著差異性，有修復骨細胞功效。

2、通過本次試驗解決干細胞分泌因子在骨修復臨床應用上有一定效果。因為干細胞分泌因屬于自體細胞，最具活力，最具影響力，未來干細胞分泌因子可以解決動物骨壞死的新型治療方法。

3、安全性由于采用體外復制技術，已具備自體細胞移植能力，對傳統治療的一種革命。

4、在骨損傷修復過程中創口愈合期最少14天能夠愈合。所以設置時間分別為14天、28天、56天。說明骨損傷愈合效果，用藥時間越長，愈合效果越好。

五、干細胞研究前景

1、干細胞分化為誘導分化細胞注射到動物機體，沒有形成腫瘤，說明對疾病治療是安全的。

2、成年干細胞也具有一定的可塑性，形成個體發育機制的材料

3、研究新藥開發，直接用于疾病治療，如骨干細胞分泌在兔機體形成骨組織修復骨損傷。

參考文獻：

[1]蔣桃，犬干細胞分泌因子對皮膚損傷修復的應用研究[D];云南農業大學;2017年 [1]

[2]斐雪濤、干細胞生物學，科學出版社，2003;4-15

[3]中華人民共和國衛生行業標準（WS233-2002）對生物安全三級（P3）實驗室進行了規定《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》。 2015年7月6日

[4]李肯、于騰波等，辛伐他汀作兔肩袖損傷修復術骨腱-骨愈合的實驗研究 中國運動醫學雜志 2019年1月

[5]陳喆（導師：汪益民），中國人民解放軍海軍愈合模型的比較?2019年6月

[6]任俊玲，血液常規檢驗 ， 獸醫實驗室診斷（第1版）[D]中國農業出版社?2019年 [24頁]

[7]目前國內通用的試驗技術方法。

[8]簡載華， 獸醫手冊[D]（第3版）江西科學技術出版社 2000年[20頁]

[9]任俊玲?獸醫實驗室診斷 [D]?（第1版）中國農業大學出版社

致謝感謝西安百奧普生物科技公司為本次試驗提供試劑、試驗材料、檢測。