靶向奶牛Lepr基因的miR-30d報告基因載體構建及靶向驗證

門晶，接晶，高學軍，李慶章

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

靶向奶牛Lepr基因的miR-30d報告基因載體構建及靶向驗證

門晶，接晶，高學軍，李慶章

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

構建靶向奶牛Lepr基因的miR-30d熒光素酶報告基因載體，驗證奶牛乳腺中瘦素受體基因（Lepr）是否為miR-30d的生物學靶基因。將microRNA熒光素酶表達報告載體特異性改造，使其含有TargetScan預測的與miR-30d靶向結合的奶牛Lepr基因序列，對miR-30d與重組熒光素酶載體質粒共轉染后的細胞裂解液進行熒光素酶活性檢測分析。結果表明，靶向奶牛Lepr基因的miR-30d熒光素酶表達報告載體構建成功，奶牛Lepr基因是miR-30d的靶基因，旨為miR-30d與Lepr基因的相互作用及與此基因相關的乳腺生物網絡調控研究奠定實驗基礎。

Lepr；miR-30d；報告基因

0 引言

MicroRNA（miRNA）是一類參與基因轉錄后調控的內源性非編碼小RNA[1，2]，其通過對靶mRNA的切割或翻譯抑制來下調目的基因表達[3]。瘦素受體（LEPR）是一種跨膜受體，通過Lepr基因的信號轉導影響著機體的多種生理過程[4，5]，并在哺乳動物乳腺發育、泌乳及退化過程中起著十分重要的作用[6-9]。本研究以荷斯坦奶牛乳腺Lepr這一泌乳相關重要功能調控基因與miR-30d靶向結合作用為切入點，通過構建miRNA熒光素酶報告基因載體對TargetScan中預測的miR-30 d的擬靶基因Lepr進行驗證，旨在為奶牛乳腺發育與泌乳調控提供必要的研究手段和奠定重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

Trizol、Lipofectamine2000（Invitrogen），ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶SpeⅠ、HindⅢ、DNA分子量標準及T4-DNA連接酶（TaKaRa），質粒小量制備與純化試劑盒、PCR產物回收純化試劑盒（Axgene），miR-30d表達質粒（GenePharma），Dual-LuciferaseReporter Assay Systerm（Promega），含Amp抗性的LB液體和固體培養基，氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑為國產分析純。

1.1.2 載體與感受態細胞

pMDTM18-T載體、JM109感受態細胞（TaKaRa），pMIR-REPORT Luciferase miRNA Expression Reporter Vector（Ambion）。

1.1.3 組織材料與細胞

本實驗室凍存的處于正常生理狀態的荷斯坦奶牛乳腺組織和乳腺上皮細胞（荷斯坦奶牛購自黑龍江省畜牧業科技園區）。

1.2 方法

1.2.1 靶基因預測與引物設計

運用生物信息學方法進行預測，在TargetScan中，檢索牛（Bta）這一物種中Lepr是否為miR-30 d的生物信息學預測靶基因。根據預測，針對Bta-miR-30 d中編碼Lepr基因mRNA的3’UTR中包含有上述靶向結合位點的185 bp目標序列進行引物設計，并在引物中引入SpeⅠ和HindⅢ兩酶切位點及其各自酶切位點的保護堿基，引物由上海英俊公司負責合成。

1.2.2 總RNA的提取與逆轉錄

取出液氮中預先凍存的荷斯坦奶牛乳腺組織，采用液氮研磨法并按照Invitrogen Trizol RNA提取說明書中的操作步驟進行總RNA的提取。選用所提取的總RNA完整度較好且質量較高的樣品進行逆轉錄反應。

1.2.3 PCR擴增與產物純化

以逆轉錄得到的cDNA為模板按照PCR反應體系與條件進行目的片段的擴增。產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析驗證，目的帶與分子量標準比對后按照膠回收試劑盒操作步驟將目的片段純化回收。

1.2.4 T載體的重組與測序

純化回收的PCR產物與pMDTM18-T載體連接，然后將其轉化至JM109感受態細胞擴增。挑選陽性克隆37℃過夜培養，得到的菌液按照質粒提取試劑盒的操作步驟提取重組T載體質粒。以該重組質粒為模板用PCR與電泳結合的方法初步鑒定，目的帶與分子量標準比對符合理論值185 bp后交TaKaRa公司測序。

1.2.5 基因載體的重組與測序

根據引物引入的酶切位點對連有目的片段的T載體用SpeⅠ和HindⅢ進行37℃過夜雙酶切，純化回收與miR-30d靶向結合并帶有相應粘性末端的目的DNA片段。利用SpeⅠ與HindⅢ將自身帶有這兩種酶切位點的pMIR-REPORT miRNA熒光素酶表達報告載體質粒37℃過夜雙酶切，將開環質粒純化回收。T4-DNA連接酶連接目的DNA片段與開環質粒，然后將重組質粒轉入JM109感受態細胞擴增。挑選陽性克隆進行37℃過夜培養后，按照質粒提取試劑盒的操作提取重組載體質粒。以該重組質粒DNA為模板，經PCR與電泳結合的方法初步鑒定后交TaKaRa公司測序。

1.2.6 細胞培養

復蘇本實驗室凍存的荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞，用體積分數為15%的胎牛血清和1倍雙抗的DMEMF-12培養液于37℃的CO2培養箱中進行培養與傳代。

1.2.7 細胞的瞬時轉染

轉染前1 d選用1瓶約90%貼壁且生長狀態良好的細胞接種于24孔板中，每孔細胞密度約為1×105個，每孔加入500 μL不含雙抗的15%胎牛血清的DMEMF-12培養液過夜培養。轉染時每孔細胞貼壁達80%以上，以靶向奶牛Lepr基因的miR-30 d重組質粒載體作為對照，每孔都轉入10 ng質粒載體pRL-TK作為標準內對照來校正各組之間的差異，具體實驗分組如下（表1）所示。轉染時重組質粒載體與miR-30d表達質粒的加入量約為每孔100 ng和500 ng，轉入質粒與轉染試劑的加入量比為1∶3，具體操作根據Lipofectamine 2000說明書進行。細胞轉染后6 h更換新鮮的培養液，轉染48 h后收集轉染細胞用于熒光素酶活性的檢測。

表1 細胞轉染實驗分組

1.2.8 熒光素酶活性檢測

轉染48 h后按照Promega公司的雙熒光素酶檢測試劑盒的操作進行熒光素酶活性檢測。棄去待測細胞的培養液，PBS清洗細胞兩次，殘留液體吸出后加入被動裂解液PLB裂解細胞15 min，收集獲得待測細胞裂解液。向測量管中加入20 μL細胞裂解液和100 μL的LARⅡ，測量得到熒光值1，再向測量管中加入100 μl的Stop&Glo試劑，測得熒光值2。值1比值2即得到相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 基因載體構建結果

TargetScan中，在牛（Bta）這一物種中Lepr是否為miR-30d的生物信息學預測靶基因的具體預測結果及靶向結合位點如圖1所示。

根據奶牛Lepr的3’UTR與miR-30 d特異性結合的位點設計出185 bp目的片段的PCR引物，該引物帶有SpeⅠ和HindⅢ兩酶切位點及其各自保護堿基，序列如下：

凍存的奶牛乳腺組織中提取的RNA完整性較好、質量較高，可以用于逆轉錄反應獲得cDNA模板（圖2）。利用已獲得的cDNA模板與引物通過PCR得到大小為185 bp的目的片段（圖3），純化回收后與pMDTM18-T載體連接，感受態擴增后純化回收，PCR法驗證回收產物（圖4）。初步驗證符合理論值185 bp后，將重組T載體質粒送出測序，測序結果正確（圖5），證明實驗已獲得含miR-30d靶向結合位點的奶牛Lepr的3’UTR序列的T載體重組質粒。

圖3中，1為DL2000 DNA分子量標準，2和3為185bp的目的片段。

圖4中，1為DL2000 DNA分子量標準，2為185bp的目的片段和重組T載體質粒。

將回收得到的帶有相同粘端的185 bp目的片段和開環miRNA熒光素酶表達報告載體質粒連接，重組熒光素酶表達報告載體質粒經感受態擴增且純化回收后測序，測序結果正確（圖6），證明靶向奶牛Lepr基因的miR-30d熒光素酶報告基因載體構建成功。

圖6 重組熒光素酶表達報告載體質粒測序結果

2.2 熒光素酶活性檢測結果

通過對本實驗室凍存的荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞的復蘇與傳代培養，獲得了可供轉染實驗的生長狀態良好的細胞（圖7）。

圖7 奶牛乳腺上皮細胞（200×）

用雙熒光素酶報告系統檢測轉染后細胞的裂解液熒光素酶的活性，利用SPSS 13.0 Duncan法對活性值進行統計分析。與重組質粒載體對照組相比，共轉染miR-30 d熒光表達質粒組使熒光素酶報告重組子的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）（圖8），可以說明TargetScan預測結果正確，奶牛Lepr是miR-30d的靶基因。

圖8 相對熒光素酶活性檢測

圖8中，A組為熒光素酶重組質粒載體，B組為熒光素酶重組質粒載體+miR-30d，C組為熒光素酶重組質粒載體+miR-139，同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

miRNA廣泛存在于動物、植物、一些病毒甚至藻類中，是小分子非編碼RNA家族的重要成員之一。miRNA通過對靶mRNA切割或翻譯的抑制來下調目的基因的表達，諸多研究表明miRNA在生長發育、增殖分化、病毒感染和腫瘤發生等多種生物學事件中扮演重要角色，準確地對靶基因進行預測是研究miRNA作用機制和其生物學功能的必備前提[10]。第一個miRNA及其靶基因是1993年通過分離和克隆細胞內小分子RNA的方法鑒定的，但此方法靈敏度很低。隨著生物信息學的發展，miRNA靶基因的生物信息學預測在miRNA靶基因的預測中起到了積極的作用，許多種靶基因預測軟件應運而生。本研究選取奶牛乳腺發育和泌乳相關重要功能調控基因Lepr為靶標基因，根據miRNA靶基因預測常用軟件TargetScan對在牛這一物種中與Lepr靶向互補結合的miRNA進行預測。預測結果表明miR-30 d與Lepr的匹配位點單一且匹配度較高，故以miR-30 d與Lepr的靶向相互作用為切入點展開研究。

報告基因是指表達產物易被檢測且能夠與內源性蛋白相區別的基因。報告基因應用廣泛、種類繁多。隨著報告基因技術的發展，熒光素酶、綠色熒光蛋白等在檢測組織和細胞基因表達、研究疾病發生機理及基因靶向治療的分子機制等方面發揮了重要作用。常見的報告基因有β-半乳糖苷酶、熒光素酶、氯霉素乙酰基轉移酶、分泌性堿性磷酸酶等[11]，但熒光素酶報告基因載體系統是目前miRNA靶基因驗證的常用方法，該方法具有操作簡便、靈敏度高的優點。

本研究通過對奶牛乳腺總RNA的提取與逆轉錄，將miR-30 d與其預測靶基因奶牛Lepr基因3’UTR結合位點在內的185 bp序列進行引物設計并PCR擴增。驗證并純化擴增產物后將其插入熒光素酶編碼區下游，成功構了建熒光素酶報告基因載體。將構建好的報告基因載體質粒轉染及與miR-30 d共轉染細胞后進行熒光活性變化檢測，并對熒光活性數值進行統計學分析。結果表明：熒光素酶載體質粒轉染組與熒光素酶載體質粒和miR-30 d共轉染組相比，熒光活性值顯著降低（P＜0.05），證明了Lepr是miR-30 d的靶基因，為進一步研究miR-30 d對Lepr基因表達及相關生物網絡轉錄后的水平調控提供了實驗分析手段。

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Construction of dairy cow Lepr targeting miR-30d reporter gene vector and verification of its targeting

MEN Jing,JIE Jing,GAO Xue-jun,LI Qing-zhang
(The Key Dairy Science Laboratory of Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To establish luciferase reporter vector of dairy cowLeprtargeting miR-30d,and identify ifLepris a target gene of miR-30d in dairy cow mammary gland.The luciferase expression reporter vector was rebuilt with the sequence whichLeprcould combine with miR-30d.The cells which miR-30d and the rebuilt vector were cotransfected in were fragmentated and the luciferase activity was detected.The luciferase expression reporter vector is constructured successfully,Lepris a target gene of miR-30d.This study establishes the experimental foundation for both the interaction between miR-30d andLeprand the regulation of miR-30d on the biological network associated withLepr.

Lepr;miR-30d;reporter gene

Q936

A

1001-2230（2011）05-0004-03

2011-01-10

國家重點基礎研究發展（973）計劃（2011CB100804），東北農業大學創新團隊計劃(CXT005-1-1/CXT005-1-2)。

門晶（1983-），女，碩士研究生，研究方向為泌乳生物學與乳腺生物調控。

李慶章