‘由良’蜜橘成年態莖段培養及微芽嫁接方法的優化*

徐 嚴，譚李梅，駱夏輝，楊 亞，唐志敏，周 閏，蔡建國

（郴州市農業科學研究所，湖南省農業科學院郴州分院，423000）

‘由良’蜜橘為日本選育的品種，系‘宮川’特早熟芽變，2006 年引入國內試驗研究[1]，在浙江省永嘉、寧海等地栽培表現良好，極具發展前景[2-3]。湖南省郴州市“東江湖蜜橘”為地理標志產品，是當地農民致富的支柱產業之一[4]。東江湖蜜橘主栽柑橘品種為‘宮川’，由于品種老化等問題導致效益降低，引進特早熟‘由良’蜜橘是提高“東江湖蜜橘”品質的有效途徑。

長期無性繁殖及頻繁的區域調運苗木使柑橘易感染病毒和類病毒病害，對柑橘產業造成嚴重損失且尚無有效的防治藥劑。近年來，柑橘黃龍病的蔓延十分嚴重，培育和栽植無病毒苗木是防控黃龍病的關鍵措施之一。珠心苗培育和莖尖培養存在童期長、果實品質不穩定等問題，且柑橘成年態植株的莖尖難以直接誘導分化成完整植株。Murashige提出莖尖微芽嫁接技術，并證實可脫除柑橘病毒病。研究表明[5-6]，莖尖嫁接技術是目前脫除柑橘病毒和類病毒最有效的方法，可成功脫除黃龍病、衰退病、裂皮病等多種病害。

從田間直接采取柑橘莖尖受季節影響較大，莖段組織培養是獲得莖尖的重要途徑之一，但柑橘成年態莖段組培過程中污染率高、芽體增殖分化低等問題制約了相關技術的發展[7]。優化柑橘成年態莖段消毒和培養方法，對提高莖尖嫁接脫毒效率，為柑橘無病毒苗木繁育提供技術支撐具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的外植體采自郴州市農業科學研究所果樹基地柑橘園，供試品種‘由良’蜜橘，砧木為枳，樹齡3 年。莖尖微芽嫁接的砧木種子為保存在實驗室的‘卡里佐’枳橙種子。

1.2 試驗處理與方法

1.2.1 砧木種子處理和試管砧木培養

挑選飽滿、無傷痕的種子，在室內用無菌水沖洗干凈后，剝去外種皮并保濕，將種子倒入滅菌培養皿中。在超凈工作臺上加入75%酒精消毒30 s，再用1%NaClO 和吐溫20 消毒20 min，然后用無菌水沖洗種子3 次。用3 種方式進行種子處理：剝除內種皮、劃破內種皮、直接播種。處理完成后，用鑷子輕輕夾住種子并送入裝有MS 固體培養基的試管里，每管1～2 粒種子，放入27 ℃的恒溫培養箱培養，14 d 后統計種子污染率和萌芽率。砧木長到10～15 cm 時，放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 外植體采集

（1）單芽莖段的采集。2020 年6 月5 日（晴天）10：00，剪取無病蟲害、半木質化枝條，裝入潔凈的塑料袋內帶回實驗室，將枝條上的葉片剪去，自來水沖洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h，再沖洗20 min，剪成2 cm 左右的單芽莖段，放入干凈的培養瓶中用無菌水浸泡保濕。

（2）多芽莖段的采集。于6 月15 日（晴天）10：00，從培養室內剪取1 年生的無病蟲害、半木質化枝條，裝入潔凈的塑料袋內帶回實驗室，將枝條上的葉片剪去，自來水沖洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h，再沖洗20 min，剪成帶有3 個腋芽的莖段，放入干凈的培養瓶中用無菌水浸泡保濕。

（3）直接采取莖尖。于6 月25 日（晴天）10：00，采取長2～3 cm 的嫩芽（帶2～3 片嫩葉），用濕潤棉花進行保濕后帶回實驗室，在實驗室內去除嫩葉，放入無菌培養皿中用無菌水保濕。

1.2.3 外植體消毒和培養

（1）單芽莖段的消毒。采用5 種方法對柑橘單芽莖段進行消毒處理，即方法A：采用1%NaClO消毒20 min→無菌水沖洗5 次；方法B：采用3%NaClO 消毒20 min→無菌水沖洗5 次；方法C：采用5%NaClO 消毒20 min→無菌水沖洗5 次；方法D：采用1%NaClO 消毒20 min→無菌水沖洗5次；方法E：用1%NaClO 消毒25 min→無菌水沖洗5 次。每種方法均先用75%酒精處理30 s，其中方法A、B、C 從田間采樣，方法D、E 從培養室采樣。

（2）多芽莖段的消毒。在超凈工作臺上進行消毒處理。先用75%酒精浸泡30 s，經無菌蒸餾水沖洗后，放入1%NaClO 中消毒20 min，最后用無菌水沖洗3～5 次。

（3）田間采集的莖尖消毒。在超凈工作臺上進行消毒處理。先用75%酒精浸泡30 s，經無菌蒸餾水沖洗后，放入0.3%NaClO 中消毒5 min，最后用無菌水沖洗3～5 次。

莖段消毒后放入MS 固體培養基中培養，培養基添加30.0 g/L 蔗糖和7.5 g/L 瓊脂。培養條件：溫度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h。每處理3 次重復，培養15 d 后統計萌芽率、污染率等。

1.2.4 單芽莖段離體培養基配制及培養

不同單芽莖段的培養基均以MS 為基本培養基，附加6-BA（濃度0.5、1.0、1.5 mg/L）和IBA（濃度0、0.05、0.1 mg/L）的不同濃度組合，每個濃度組合培養20 個單芽莖段，重復3 次。30 d 后觀察記載萌芽數量。培養條件：溫度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h。

1.2.5 莖尖微芽嫁接及培養

在解剖鏡下剝取含有2～4 個葉原基的莖尖嫁接于試管砧木苗上，放入MS 液體培養基中培養。培養條件：溫度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h，光照強度為1 000～2 000 lx。每處理3 次重復，培養15 d 后統計腋芽數、出芽數、可用芽數，計算增殖倍數和利用率。

1.3 數據統計分析

試驗數據采用Excel 2007 和SPSS 17.0 進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理方式試管播種對砧木種子萌發的影響

由表1 可知，內種皮不同處理間的污染率具有顯著性差異，內種皮剝除面積越大種子污染率越高，其中直接播種的污染率為17.5%，劃破內種皮的污染率為32.5%，剝除內種皮的污染率達75.0%。剝除內種皮和劃破內種皮的萌芽率均顯著高于直接播種，為60.0%，直接播種的萌芽率僅為32.5%。由于最終目的是獲得無污染的萌芽種子，故劃破內種皮是砧木種子試管播種處理的理想方式。

表1 不同處理方式對砧木種子在14 d 萌發的影響

2.2 成年態莖段消毒方法的篩選

由表2 可知，不同消毒試劑、消毒時間及采樣地點對‘由良’蜜橘成年態莖段的消毒效果均有影響。從田間采集的外植體中，NaClO 的濃度越高污染率越低，褐化率越高，且均具有顯著差異。其中，1%NaClO 的污染率最高，為35.0%，褐化率最低，為45.0%；5%NaClO 的污染率最低，為5.0%，褐化率最高，為90.0%。試驗中發現，成活的成年態莖段初期均可萌芽，但由于污染和褐化等原因導致后期無法繼續生長，隨著NaClO 濃度的升高萌芽率隨之降低，其中1%NaClO 的萌芽率最高，為20.0%。

表2 不同消毒方法對‘由良’蜜橘成年態單芽莖段消毒效果的影響

為了提高消毒效果，增加萌芽率，將試材從田間轉移至培養室培養，在培養室中抽梢，保持干凈的培養環境，避免枝條感染過多真菌或細菌。試驗結果表明，從培養室采集的成年態莖段用1%NaClO消毒時間為20 min 和25 min 的污染率一樣，但褐化率降低。消毒20 min 的萌芽率達到70.0%，比從田間采樣高50 個百分點，差異達顯著水平（表2）。

綜上所述，NaClO 濃度越高莖段污染率越低，褐化率越高，萌芽率越低，且從培養室采集的莖段污染率、褐化率都顯著低于田間采集的，萌芽率顯著高于田間采集的，即從培養室采集的成年態莖段用1%NaClO 消毒20 min 的消毒效果最好，污染率為20.0%，褐化率為10.0%，萌芽率達70.0%（表2）。

2.3 不同植物生長調節劑配比對莖段離體培養的影響

為了獲得更多的莖尖數量，提高‘由良’蜜橘脫毒效率，以MS 為基本培養基，添加不同植物生長調節劑配比，分析不同培養基誘導單芽莖段的效果，并同時觀察不同培養基條件下莖尖數量是否有差異。由表3 可以看出，6-BA 為0.5 mg/L、IBA 為0 時萌芽率最高，達95.5%，但增殖倍數最低；6-BA為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時萌芽率次之，為91.6%，但增殖倍數最大，達3.0。綜合來看，6-BA為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時，對‘由良’單芽莖段離體培養的效果最好。

表3 不同植物生長調節劑配比對單芽莖段離體培養 的影響

2.4 莖尖來源對微芽嫁接增殖倍數和利用率的影響

在莖段培養的增殖過程中，單芽莖段多存在部分不定芽不具莖尖無法進行脫毒試驗。單芽莖段和多芽莖段的不定芽的生長速度均不一致，反復拿出莖段取出莖尖的過程會增加污染率，導致后續得到的莖尖無法利用。因此，對不同莖尖來源的增殖倍數和利用率做了對比，其中，單芽莖段使用最佳培養基MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L IBA 培養，多芽莖段使用MS 基本培養基培養。試驗結果表明（表4），從培養室直接采取莖尖進行后續試驗無法增殖，多芽莖段的不定芽再生增殖倍數為2.2，單芽莖段的不定芽再生增殖倍數最大，可達3.0，顯著高于多芽莖段的不定芽。但多芽莖段不定芽利用率顯著高于單芽莖段不定芽利用率，達81.8%。同時，在外植體數量相同的情況下，由于腋芽數量的差異會影響獲得的可用芽數量，多芽莖段產生的不定芽數量顯著高于單芽莖段。綜上所述，使用多芽莖段產生不定芽的方式來獲得莖尖進行脫毒試驗的方法最優。

表4 莖尖來源對微芽嫁接增殖倍數和利用率的影響

3 討論與結論

雖然利用成年態組織培養已經有一定的培養體系，但外部細菌、真菌和內生菌較多，導致污染率高和褐化率高的問題一直存在。利用脫除內外種皮的方法減少萌發阻力，是加快萌芽速度的有效方法。吳思夢等[8]研究表明，剝除內外種皮使用不同消毒方法的污染率最高為5.6%。本研究在實際操作過程中發現，在超凈工作臺上剝除內種皮需要較長時間，可能由于人為操作不當，污染率增加。從試驗結果能看出，劃破內種皮的方式可以大幅減少操作時間，降低污染率。陳國華等[9]發現，0.1%HgCl2消毒效果比10%NaClO 溶液好，最高成活率可達86.09%。由于升汞的安全系數不高，本研究還是采用NaClO 消毒，結果發現NaClO 濃度達到5%時，褐化率高達90.0%，萌芽率僅為5.0%，可能是由于采集的莖段成熟度不一致，與陳澤雄等[10]發現不同成熟度的材料消毒效果不同的研究結果相一致。很多研究表明，不同季節、不同天氣取樣會影響污染率[8,11]。本研究選擇在晴天干燥的環境下取樣，以降低污染率，但試驗進程非常緩慢。考慮到田間環境微生物眾多，故在培養室中直接培養原材料能控制環境條件，結果也表明在干凈的環境條件下生長的外植體污染率均只有20.0%，且使用1%NaClO 消毒時培養室內生長的外植體較室外生長的外植體污染率顯著降低。

將莖尖嫁接在無毒砧木上解決了發根難、生長慢等問題，應用十分廣泛。由于田間采集接穗受季節、天氣影響較大，多數研究者利用組織培養獲得莖尖進行脫毒。前人多對莖段先進行初代培養再進行繼代培養以獲得莖尖，劉月[12]的研究結果表明，6-BA 的濃度越高，誘導率越高，但超過1.0 mg/L 時可能會導致愈傷組織增加、不定芽質量降低。本研究發現，誘導成功后側芽會陸續冒出，可直接增殖來獲得莖尖加快脫毒效率，但不同的植物生長調節劑水平下不定芽的粗壯程度不同。6-BA 濃度為1.0 mg/L、IBA 為0.05 mg/L 時，對‘由良’單芽莖段離體培養效果最好，萌芽率為91.6%，增殖倍數為3.0。

陳毅群等[13]、李麗[14]的研究表明，采集田間接穗進行微芽嫁接受季節影響較大，夏季萌發率最高，春秋季萌芽率顯著低于夏季，利用誘導不定芽進行微芽嫁接的萌發率不受季節影響且顯著高于田間芽。本試驗通過培養室培養原材料，控制溫濕度讓植株處于最佳抽梢環境條件，也可避免接穗受季節影響導致萌發率不高的現象，但結果表明脫毒使用的莖尖在萌芽1 周左右采集脫毒效率最高，無法在短期內將植株上所有莖尖全部利用上，而通過莖段培養，可以分批次獲取莖尖。試驗結果表明，使用多芽莖段培養的不定芽利用率最高，達81.8%。

莖尖嫁接技術是目前使用最廣泛的柑橘脫毒技術，此前多在莖尖大小、嫁接方法上研究以提高脫毒率，本研究主要利用組織培養獲得莖尖，以打破季節限制加快脫毒效率。在前人基礎上對種子、成年態莖段消毒方法和培養方法及莖尖來源進行研究，在一定程度上增加了獲取莖尖的數量和質量。