基于適體傳感器的Cu2+檢測研究

黃小凡

（合肥工業大學,安徽合肥,230009）

0 引言

近年來，隨著工業農業的發展，各種工業廢水直接排出，導致土壤和水體中的銅含量極具增加[1]，銅可以在土壤和水體中逐漸積累并且很難消失，近年來我國土壤中的銅含量嚴重超標，已經達到土壤背景值的幾十倍，許多冶煉廠附近的銅含量高達809.30～1395.54mg/kg，嚴重抑制了植物的生長。另外Cu2+雖然在人類的各種生理過程中起著至關重要的作用，但是，過量的銅會對生物體產生毒性，即使短時間暴露在高濃度的銅中[2]，也可能會引起胃腸道疾病，長期接觸會造成肝臟或腎臟損害[3],為了維持健康的身體，根據國家研究委員會（NRC），嬰兒每天消耗0.4-0.6μmg 的銅，兒童每天消耗1.5-2.5μmg 的銅，成人每天消耗1.5-3.0μmg 的銅,因此，從環境和人類健康監測的角度出發，開發一種方便可靠的Cu2+檢測方法具有重要意義。

多種分析檢測技術已廣泛用于測定Cu2+，包括原子吸收光譜法，電感耦合等離子體質譜法，紫外可見光譜法，但是他們需要笨重的設備，復雜的預處理過程，檢測能力差等一系列缺點，本文提出的適體傳感器檢測技術因其成本低，響應速度快，檢出限低（LOD），出色的靈敏度和選擇性而備受廣泛關注。

1 傳感器的識別機制

1.1 特異性識別Cu2+

本文使用SSA-CuII 適體作為識別Cu2+的特異性探針[4],其適體篩選過程為：適體文庫中每一條適體的中心是恒定域，兩側是兩個隨機域，金屬離子與隨機域結合，導致紅色分子從中間恒定域脫離，紅色分子的脫離導致紅色熒光減少，可以通過熒光激活細胞分選法（FACS）檢測到，將紅色固定分子脫離以后的適體篩選出來，經過克隆和測序即可得到特異性SSA-CuII 適體。

1.2 傳感器檢測過程中電容的變化

當電極浸入電解液時，電極/流體系統可以簡化為由電容元件和電阻元件構成的等效電路網絡系統，當一個頻率范圍低于百千赫茲的交流信號施加在電極兩端時，此時的等效電路網絡可以簡化為兩個界面電容Cint和一個電解質電阻Rf的串聯[5],使用阻抗分析儀測量的Cint值即為傳感器對Cu2+響應直接轉換的電學信號，因此，測量電容值的變化可以用來表示溶液中Cu2+的濃度。

對于功能之前的裸電極，其界面電容（Cint）主要來自于傳感表面形成的雙電層（EDL），當電極浸沒在溶液中時，電極表面將獲得表面電荷，為了保持電荷中性，在電極/液體邊界的一個薄層中誘導反離子來對抗電極表面的電荷，這通常被稱為雙電層（EDL），將反離子層作為一個平板，電極表面作為另一個平板，可以將EDL 模擬為界面電容器，當目標分子被收集到電極表面時，EDL 的厚度會增加，從而降低傳感器的界面電容。

如圖1 所示的識別過程示意圖，在電極功能化以后，探針-目標物結合過程中界面層厚度的增加會導致界面電容（Cint）的減小，這是由于使用ACEK 信號并且以電學方式檢測到，在這項工作中，對Cint進行測量，并將其用作適體-目標物結合的指標，如圖1（a）所示，在適體與Cu2+結合之前，初始界面電容Cint可以表示為：

圖1 傳感器表面的電容變化過程

其中A 為界面電容的有效表面積，ε EDL和εapt分別為溶液和適體的介電常數，D EDL和Dapt分別為EDL 層和適體層的厚度，檢測過程中Cu2+受到ACET 流的推動與電極表面固定的適體相互結合使介電層變厚，此時界面電容Cfint可表示為：

其中εCu為Cu2+的介電常數，D Cu為Cu2+層的厚度，在這項研究中，該電容的變化?C作為一個非常敏感的參數，被用來作為指標來反映靶標的結合程度，這與不同的Cu2+水平直接相關，為了減小初始電容不一致造成的檢測誤差，引入歸一化電容?C/Cfint作為標準結果，其表達式為：

?C是1 分鐘內的電容變化，?C/Cint可以直接指示電極表面上結合Cu2+的水平，表明界面電容是定量指標，在后面的部分中，每分鐘的?C/Cint表示為dC/dt。

1.3 Cu2+的富集機制

為了實現快速檢測，將分析物集中到傳感器上的結合位點是減少響應時間和提高靈敏度的必要技術，在基于傳感器檢測分析中，盡管從檢測結果來看達到了預期，但絕大多數由于待測分析物向受體擴散效率低，可能導致檢測時間長達數小時甚至數天，這樣就無法滿足實時檢測的要求，為了克服這一局限性，加快檢測過程，本文利用交流動電效應（ACEK）作為一種有效的Cu2+富集方法，ACEK 效應主要是用于研究液體環境中電解質和極化粒子在交流電場作用下的行為，在交流電場的影響下，由于流體中的感應電荷會隨外電場改變其極性，即可產生非振蕩的粒子或流體運動，一般來說，誘導納米顆粒做定向移動的ACEK 效應主要有三種:介電泳（DEP）、交流電滲（ACEO）和交流電熱（ACET），三者的共同作用均是加速待測分析物與識別探針進行結合，降低傳感器響應時間。

2 材料與方法

2.1 試劑準備

使用稀釋以后的磷酸鹽緩沖液把制備好的適體稀釋到一定的濃度，以備后續功能化電極使用，6-巰基-1-己醇（6-MCH）作為封閉劑，使用PBS 緩沖液進行稀釋，從現有市場上購買Cu2+標準樣品，將其在PBS 緩沖液中稀釋以備后續目標離子的檢測實驗。

2.2 傳感器的制備與測量過程

本文中使用的叉指電極（IDE）傳感器是通過PCB 生產工藝制造的，作為基板的玻璃纖維板的厚度被設計為1.6mm，叉指電極圖案印刷在基板的銅膜上，借助于鎳結合層將金膜電鍍在銅電極上，其總體規模為3cm×1.5cm，相鄰兩個叉指電極的間距及單個叉指的寬度均為0.1mm。將上述規格的電極經過清洗、貼微型腔室、紫外線、孵育等一系列工作以后，將其兩個引腳接口連接到阻抗分析儀上可進行Cu2+的檢測工作，如圖2（a）所示，圖2（b）為傳感器表表面叉指電極的局部放大圖。

圖2

3 實驗結果

3.1 傳感器的頻譜分析

為了初步判斷適體是否被固定在電極表面，在頻譜測量之前，可通過測量電極孵育前后的電容值進行判斷，孵育之后因為適體的綁定會使得電容值大幅度下降，測量結果如圖3 所示，這表明適體被很好的固定在了電極表面，由于6-MCH分子比適體小很多，所以封閉以后電容值下降較小。

阻抗分析在驗證傳感器是否被功能化方面也起著相同的作用，我們使用阻抗分析來分析功能化前后的阻抗參數，根據1.2 部分的理論分析可知，在功能化之后，電極表面電容變小并且阻抗模量變大，圖4 表明在適體被固定以后，阻抗模量顯著增加，而在用6-MCH 封閉后，阻抗模量略有增加。

3.2 傳感器的可行性

為了驗證本方案的可行性，在頻率為1 kHz、電壓為300 mV 的交流信號下，對兩組不同濃度的Cu2+標準液（50 fM、0.5 pM）進行可行性實驗，圖5 顯示了使用不同傳感器從三次測試中獲得的平均值和標準偏差，可以看到隨著樣品溶液中Cu2+濃度的增加，傳感器歸一化電容響應也隨之增大，與此同時，在同等條件下對背景緩沖液進行了測量，其響應值遠低于含Cu2+的溶液，這表明傳感器對背景緩沖液無響應，這也初步證明該適體對Cu2+是具有特異性的，由此可得本方案作為一種高效的Cu2+監測技術確實是可行的。

圖5 傳感器對不同濃度Cu2+溶液的響應

4 總結

本文提出了一種快速靈敏的Cu2+檢測技術，利用ACEK效應加速目標離子與特異性適體結合，能夠快速實時靈敏的檢測Cu2+，使用適體功能化電極對Cu2+進行特異性識別，同時，傳感器的固液界面電容將反映目標離子在傳感器表面的吸附程度，以指示溶液中銅離子的濃度，本研究和已存在的技術相比，檢測更加快速，樣品預處理過程十分簡單，這對于人體中Cu2+的動態平衡和環境水樣中有害Cu2+的監測具有重大意義。