p16、微型染色體維持蛋白2、Ki-67在宮頸鱗狀上皮內病變的表達與意義

蔣莉萍，吳鳳珍，肖 艷，胡利娟，劉媛媛

（1.吉安市婦幼保健院病理科；2.吉安市婦幼保健院婦產科，江西 吉安 343006）

宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）是一組與宮頸浸潤癌密切相關的癌前病變的統稱，以CINⅠ為低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級為高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），因此早期診斷與治療子宮頸鱗狀上皮內病變（squamous intraepithelial lesion, SIL）是降低宮頸癌發病率與死亡率的關鍵。p16是多種腫瘤抑制基因，是一種細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，其被視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）介導的G1/S期轉化所調控，可在持續性高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染機體中過度表達并導致細胞周期失控；Ki-67是一種最常用的細胞核增殖標志物，可表達于除G0期之外的各細胞周期階段；p16與Ki-67均可作為細胞周期調控失調的標志物，其水平與HR-HPV誘導的癌性轉化相關，但因p16存在假陽性和陰性的情況，且Ki-67特異性有待提高，所以需聯合其他分子標志物來提高SIL的診斷準確度[1-2]。微小染色體維持蛋白2（MCM2）是一種細胞增殖標志物，在真核細胞DNA復制的起始和延伸過程中發揮重要作用，同時其只表達處于增殖活動周期的細胞內，若陰性表達，則意味著細胞退出細胞的增殖周期，成為分化成熟的細胞或進入G0期，因此MCM2蛋白也可以作為細胞增殖的特殊標記物[3]。但目前關于MCM2在SIL組織中的表達情況研究較少，因此本研究旨在探討p16、MCM2、Ki-67在SIL中的表達意義，并分析三者陽性表達的相關性，現將研究結果詳細報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析吉安市婦幼保健院2017年7月至2019年10月收治的240例CIN患者的臨床資料，年齡18～68歲，平均（40.66±9.15）歲；另回顧性分析同期收治的50例慢性宮頸炎患者的臨床資料，年齡35～66歲，平均（45.74±9.29）歲；另回顧性分析同期收治的20例宮頸浸潤性鱗癌患者的臨床資料，年齡25～61歲，平均（44.64±8.43）歲。診斷標準：參照《WHO（2014）女性生殖器官腫瘤分類解讀》[4]中關于CIN與宮頸癌的相關診斷標準。納入標準：所有患者均對應符合上述診斷標準；均經宮頸活檢、宮頸管診刮檢查，并經病理診斷確診；均已婚；年齡18周歲以上；已婚或有過性生活史；CIN及宮頸浸潤性鱗癌患者進行宮頸LEEP術切除治療，慢性宮頸炎患者經保守治療；臨床資料完整。排除標準：接受相關放化療治療者；妊娠或哺乳期婦女；合并其他惡性腫瘤及其他器質性病變者等。3組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P> 0.05），組間具有可比性。本研究已經吉安市婦幼保健院醫學倫理委員會批準實施。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 采用SP法免疫組織化學染色檢測MCM2、p16、Ki-67在病理組織中的表達情況：病理標本經4%中性甲醛固定，常規制作石蠟組織切片，進行免疫組織化學染色，所涉一抗：兔抗人MCM2單克隆抗體（克隆號：EP40），鼠抗人p16單克隆抗體（克隆號：1C1），鼠抗人Ki-67單克隆抗體（克隆號：UMAB107），均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將已知的陽性組織作陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。

1.2.2 免疫組織化學染色結果判定方法 采用半定量評分法據每張切片陽性細胞百分數及染色程度進行計分。①p16陽性表達定位于細胞核和細胞漿，根據細胞核和或細胞漿染色強度進行計分：無表達為0分；淡黃色為1分；（+）黃色為2分；（++）棕黃色為3分；據陽性細胞百分比將結果分為<10%為（-），計0分；11%～25%為（+），計1分；26%～50%為（++），計2分；51%～75%為（+++），計3分；>76%為（++++），計4分。②MCM2和Ki-67陽性表達定位于細胞核，根據陽性細胞分布情況判定：陽性細胞在鱗狀上皮分布的垂直平面，由下向上，基底層與基底旁細胞著色判為（-），計0分；將基底旁細胞以上至表層分為2份，下1/2細胞著色判為（+），計1分；超過下1/2細胞著色判為（++），計2分；染色強度評分方法同p16。p16、MCM2、Ki-67免疫組化染色評分=染色強度評分+陽性細胞百分比評分，分值范圍0～7分，其中 < 2分為（-）；2～3分為（+），≥4分（++）。經3位病理高級醫師判定，在判定結果中若同一病例存在不同評分視野，則取最大值和最小值的平均值；參考半定量標準，隨機觀察5個高倍視野，計算陽性細胞百分比及染色強度評分。結果均經2次重復觀察，計分不一致者再次觀察確認。

1.3 觀察指標 ①觀察典型病例p16、MCM2、Ki-67免疫組織化學染色結果；②統計并比較不同患者病理組織中p16、MCM2、Ki-67 陽性表達情況；③分析 p16、MCM2、Ki-67陽性表達的相關性。

1.4 統計學方法 將本研究所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析，計數資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗；雙變量相關性分析采用Spearman等級相關性分析。以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p16、MCM2、Ki-67陽性表達情況 p16在正常子宮頸鱗狀上皮組織中呈陰性表達（-），見圖1-A；在LSIL組織中呈陽性表達（+），上皮基底層及副基底層細胞連續彌漫陽性，見圖1-B；在HSIL、鱗癌組織中呈陽性表達（++），全層彌漫陽性，見圖1-C。MCM2、Ki-67在正常子宮頸鱗狀上皮基底層組織中呈陰性表達（-），見圖2-A、圖3-A；MCM2、Ki-67在LSIL組織呈陽性表達（+），上皮下1/2區域陽性，見圖2-B、圖3-B；MCM2、Ki-67在HSIL和鱗癌組織中呈陽性表達（++），全層彌漫陽性，見圖 2-C、圖3-C。統計學分析顯示，CIN Ⅰ級、CIN Ⅱ～Ⅲ級、浸潤性鱗癌患者病理組織中p16、MCM2、Ki-67陽性表達率均顯著高于慢性宮頸炎患者，且CINⅡ～Ⅲ級、浸潤性鱗癌患者顯著高于CINⅠ級患者，差異均有統計學意義（均P< 0.05），見表1、表2、表3。

表1 不同宮頸病變患者病理組織p16陽性表達情況比較

表2 不同宮頸病變患者病理組織MCM2陽性表達情況比較

表3 不同宮頸病變患者病理組織Ki-67陽性表達情況比較

2.2 p16、MCM2、Ki-67表達的相關性Spearman相關性分析顯示，p16與MCM2陽性表達呈正相關（r= 0.691）；p16與Ki-67陽性表達呈正相關（r= 0.556）；MCM2與Ki-67陽性表達呈正相關（r= 0.676），差異均有統計學意義（均P<0.05），見表4。

表4 p16、MCM2、Ki-67表達的相關性

3 討論

眾所周知，宮頸癌癌前病變病理組織學診斷中CIN分級的不一致性問題一直存在，尤其對于一些年輕且診斷經驗不足的病理診斷醫師和非婦科病理醫師來說，普遍存在CINⅡ級的低診斷率現象。CINⅡ級屬于一種生物學上模棱兩可的病變，在現實工作中其診斷的可重復性差。近年來，p16、Ki-67雖已在輔助宮頸癌前病變的病理診斷中廣泛應用，但p16、Ki-67的表達與細胞病變程度常常不一致，并受外界因素干擾較大，且p16、Ki-67對低危型人乳頭瘤病毒（LR-HPV）感染所致的宮頸病變易漏診和誤診[5]。因此，尋找敏感度與特異度更高的分子標志物在臨床診斷中意義重大。

在沒有免疫組化輔助手段的診斷時代，病理診斷醫師只能借助各自積累的經驗來判斷。LAST項目認為，當形態學不能診斷為CINⅠ級、CINⅢ級時，為了盡可能地降低誤診而不贊成過度使用p16，同時不提倡在LSIL診斷中采用p16的免疫組化，其認為，在蘇木精-伊紅（HE）染色為LSIL的前提下，p16免疫組化對于預后并無預測意義；不能因為p16陰性或斑片狀陽性而將病變級別降為陰性，也不能因核漿彌漫著色、強陽性、點狀著色p16表達陽性而將其病變升級為HSIL[6]。當患者為LR-HPV感染所致的CINⅠ級病變時，p16常常顯示陰性或局灶斑片著色，而MCM2此時大多能標記副基底層以上的細胞（大于黏膜厚度的25%～30%），故說明MCM2恰好能彌補p16的缺陷和不足。因此，依靠MCM2獲得診斷信息而增加CINⅠ級的診斷依據，并與Ki-67標記的增殖指數相結合，能更好地輔助HE切片病理診斷。對于微小不易發現或極易漏診的病灶，MCM2也能和p16一樣將病變處凸顯出來，增加異常病變的檢出率[7]。本研究結果顯示，CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級、浸潤性鱗癌患者病理組織中MCM2、Ki-67陽性表達率均顯著高于慢性宮頸炎患者，且 CINⅡ～Ⅲ級、浸潤性鱗癌患者顯著高于CINⅠ級患者，提示MCM2與Ki-67能準確地反映鱗狀上皮細胞的增殖程度。

MCM2作為DNA復制許可蛋白和前復合物的重要組成成分，在DNA復制啟動和DNA損傷修復中發揮著重要作用，其表達失調可導致細胞異常增殖與惡變傾向[8]。HR-HPV在宮頸癌前病變中發生、發展中起著重要作用，其通過E6、E7癌蛋白與抑癌蛋白P53和pRb結合及調控來明顯改變細胞生長周期和影響DNA修復，從而促發癌變；E7蛋白降低了pRb的穩定性，而pRb減少會致p16的高表達導致細胞增殖而瘤變[9]。E6、E7癌蛋白也可與其他分子結合來破壞細胞增殖，并通過E2F轉錄因子途徑介導的基因轉錄異常激活和異常S期誘導而致MCM2過表達，而p16過表達又會通過E2F轉錄因子介導的細胞周期異常激活途徑使MCM2過表達而惡變[10]。本研究結果顯示，MCM2與p16、Ki-67的表達均呈正相關，p16與Ki-67的表達呈正相關，故p16、MCM2、Ki-67三者之間的表達具有明顯相關性，呈正相關。

綜上，慢性宮頸炎患者、CIN患者及浸潤性鱗癌患者宮頸組織中p16、MCM2、Ki-67均異常高表達，且三者陽性表達均與SIL病變嚴重程度正相關，p16、MCM2、Ki-67三者陽性表達也具有顯著正相關性；提示將MCM2加入SIL病變的日常診斷中，可以使SIL，尤其是LSIL的病理診斷更精準，值得臨床進一步深入研究。