超高效液相色譜法測(cè)定濃縮飼料中維生素K3含量的不確定度評(píng)定

畢融冰 趙 卉 王玉方 孫紫薇 金美伶 劉繼永

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所， 長(zhǎng)春 130000)

測(cè)量不確定度(measurement uncertainty，MU)，簡(jiǎn)稱不確定度，是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量值分散性得的非負(fù)參數(shù)[1]。不確定度一般由若干分量組成，其中一些分量可以根據(jù)一系列測(cè)量值的統(tǒng)計(jì)分布進(jìn)行評(píng)定(A類測(cè)量不確定度)；另一些分量則可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或其它信息獲得的概率密度函數(shù)進(jìn)行評(píng)定(B類測(cè)量不確定度)[2]。通過比較測(cè)定過程中各分量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，并對(duì)產(chǎn)生不確定度的主要來源進(jìn)行分析，可以找出對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響的因素并加以控制[3-5]。

維生素K為肝臟合成酶的必須物質(zhì)，并參與骨骼素的合成，防止畜禽體質(zhì)軟弱、皮下出血，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用，適當(dāng)補(bǔ)充維生素K，可以避免維生素K缺乏癥，因此被廣泛用作飼料添加劑。《飼料添加劑品種目錄(2013)》[6]收錄了亞硫酸氫鈉甲萘醌(MSB)、亞硫酸氫煙酰胺甲萘醌(MNB)、二甲基嘧啶醇亞硫酸甲萘醌(MPB)三種維生素K3類飼料添加劑，三者均以甲萘醌為官能團(tuán)[7]。目前飼料中維生素A、D3、E和B2的不確定度研究已見報(bào)道[5,8-10],張艷紅等[5]利用HPLC法對(duì)預(yù)混合飼料中維生素A、維生素D3和維生素E的測(cè)定進(jìn)行不確定度評(píng)定，結(jié)果表明：采用最小二乘法求得樣品質(zhì)量濃度的過程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配置過程中引入的不確定度貢獻(xiàn)較大；陳楓等[10]利用HPLC法對(duì)預(yù)混合飼料中維生素B2的測(cè)定進(jìn)行不確定度評(píng)定，結(jié)果表明：重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線擬合中引入的不確定度貢獻(xiàn)較大；而飼料中維生素K3的不確定度研究較少，本文依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18872-2017和JJF1059.1-2012國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范，建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)UPLC法測(cè)定濃縮飼料中維生素K3的含量進(jìn)行不確定度的評(píng)定，以期找出對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大的因素，為濃縮飼料中維生素K3的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氯甲烷、無水碳酸鈉、無水硫酸鈉、硅藻土(均為分析純)；甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)品(98.08 %，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer)；試驗(yàn)用水均為一級(jí)水；濃縮飼料(隨機(jī)選取市售濃縮飼料)。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀(Acquity UPLC H-Class，美國(guó)Waters公司)，配有二極管陣列(PDA)檢測(cè)器；Mettler-Toledo MS204S 電子天平(d=0.0001 g)，Mettler-Toledo XS205電子天平(d=0.00001 g)；高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；氮吹儀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；調(diào)速多用振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)品25 mg(精確至0.00001 g)于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混勻，為甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存。準(zhǔn)確吸取0.50 mL甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混勻，為甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)工作液，工作液濃度約為5 μg·mL-1，-18 ℃保存。

1.3.2試樣溶液的制備

濃縮飼料過60目篩，混勻，稱取5 g(精確至0.0001 g)于100 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL三氯甲烷，放在調(diào)速多用振蕩器上振蕩2 min；加入5 mL 1 mol·L-1碳酸鈉溶液，振蕩3 min；加入5 g硅藻土和無水硫酸鈉混合物(3:20，g/g)，振蕩30 min；5000 r·min-1，離心10 min。

依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定分取量，準(zhǔn)確吸取20 mL三氯甲烷提取液，氮?dú)獯蹈桑状既芙猓ㄈ葜? mL棕色容量瓶中，通過0.22 μm有機(jī)系濾膜，用于UPLC分析。

1.3.3色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18反相色譜柱(2.1×100 mm，1.7 μm美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25，V/V)；柱溫：室溫；流速：0.4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：251 nm；進(jìn)樣量：3 μL。

1.3.4定量測(cè)定

依次注入相應(yīng)的甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液，根據(jù)色譜峰面積的響應(yīng)值，用外標(biāo)法定量測(cè)定。

2 測(cè)量不確定度的評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型

維生素K3的含量計(jì)算：

(1)

式(1)中：X為濃縮飼料中甲萘醌的含量，mg·kg-1；A1為濃縮飼料試樣溶液峰面積值；V1為提取液總體積，mL；V3為定容體積，mL；ρ為甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，μg·mL-1；A0為甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積值；m為濃縮飼料質(zhì)量，g；V2為提取液分取體積，mL。

2.2 不確定度來源分析

濃縮飼料中維生素K3含量測(cè)定的不確定度來源如圖1所示。

圖1 濃縮飼料中維生素K3含量測(cè)定的不確定度來源

由圖1，對(duì)濃縮飼料中維生素K3含量測(cè)定結(jié)果有影響的各種不確定度分量來源進(jìn)行分析，主要有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液所產(chǎn)生的不確定度；試樣溶液產(chǎn)生的不確定度，包括試樣稱量、試樣溶液制備過程所產(chǎn)生的不確定度；樣品處理操作過程的差異，即回收率產(chǎn)生的不確定度；儀器測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度，包括試樣溶液峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品峰面積產(chǎn)生的不確定度。

2.3 不確定度分量的評(píng)定

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生的不確定度，屬于B類不確定度。

2.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)品由德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知其擴(kuò)展不確定度為0.56 %(k=2)，純度為98.08 %，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.1.3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的不確定度

稱取甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混勻，為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；使用0.5 mL分度吸量管準(zhǔn)確吸取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混勻，得到濃度為5 μg·mL-1甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程產(chǎn)生的不確定度

則由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0186

由上述不確定度分量可以得到甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.2試樣溶液產(chǎn)生的不確定度

試樣溶液產(chǎn)生的不確定度包括試樣稱量、試樣溶液制備過程產(chǎn)生的不確定度，屬于B類不確定度。

2.3.2.1試樣稱量產(chǎn)生的不確定度

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2.2試樣溶液制備過程產(chǎn)生的不確定度

稱取5 g試樣于100 mL具塞錐形瓶中，用50 mL單標(biāo)線吸量管準(zhǔn)確加入50 mL三氯甲烷，振蕩2 min；用5 mL分度吸量管加入5 mL碳酸鈉溶液，振蕩3 min；5000 r/min，離心10 min。用20 mL單標(biāo)線吸量管準(zhǔn)確吸取20 mL提取液，氮?dú)獯蹈桑状既芙猓ㄈ葜? mL棕色容量瓶中，備用。

表2 試樣溶液制備過程產(chǎn)生的不確定度

則試樣溶液制備過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.00773

由上述不確定度分量可以得到試樣溶液制備過程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3儀器重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的不確定度

2.3.3.1標(biāo)準(zhǔn)品峰面積(A0)重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的不確定度

則標(biāo)準(zhǔn)品峰面積(A0)重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3.2試樣溶液峰面積(A1)重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的不確定度

則試樣溶液峰面積(A1)重復(fù)測(cè)量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由計(jì)算公式計(jì)算試樣溶液中維生素K3的含量：

2.3.4試樣中添加回收率產(chǎn)生的不確定度

則試樣中添加回收率產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

用t檢驗(yàn)法來考察回收率R與1之間是否具有顯著性差異:

t值大于雙側(cè)臨界值t(95，5)=2.571，則回收率R與1之間具有顯著性差異，需要回收率R校正測(cè)定結(jié)果，則試樣溶液中維生素K3的含量為：

2.4 合成相對(duì)不確定度和擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。

表3 各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

則合成相對(duì)不確定度為：

取包含因子k=2(置信水平為95%)，則測(cè)得試樣溶液中維生素K3的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

U(X)=k·urel(X)=2×0.0233=0.0466

2.5 結(jié)果報(bào)告

經(jīng)回收率R校正,試樣溶液中維生素K3的含量為1.42 mg·kg-1，則其擴(kuò)展不確定度為：

U=U(X)·X=0.0466×1.42=0.07mg·kg-1

故本試驗(yàn)濃縮飼料中維生素K3的UPLC法測(cè)定結(jié)果為：1.42±0.07mg·kg-1，k=2(95%置信度)。

3 分析

由圖2可知，UPLC測(cè)定濃縮飼料中維生素K3含量的過程中對(duì)不確定度影響最小的是urel(A0)，其次是urel(R)、urel(s)和urel(A1)，urel(r)是影響本次試驗(yàn)結(jié)果的主要來源，由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度分量中，urel(Vr)是主要影響因素。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各分量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜上，配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液過程中，適當(dāng)增大分取體積，使用經(jīng)過檢定/校準(zhǔn)合格的量器，避免實(shí)驗(yàn)操作過程中實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)過大，可以減小由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。實(shí)驗(yàn)涉及的重要儀器設(shè)備應(yīng)定期檢定/校準(zhǔn)和維護(hù)，保證儀器設(shè)備狀態(tài)，降低由儀器設(shè)備引入的不確定度。通過避光操作，減小實(shí)驗(yàn)過程中甲萘醌遇光分解產(chǎn)生的損失，減小添加回收率產(chǎn)生的不確定度。通過以上實(shí)驗(yàn)操作，來減小各分量產(chǎn)生的不確定度，進(jìn)而達(dá)到提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的目的，為濃縮飼料中維生素K3的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。