原子力顯微鏡成像技巧的探討

鄭美青 薛 冰

(首都醫科大學 中心實驗室，北京 100069)

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy, AFM)原理是在反饋控制系統的作用下，根據針尖曲率半徑在納米尺度的微小探針與樣品間的相互作用，去感觸樣品表面形貌的變化，就如同人在大腦地控制下，用手去感觸物體表面形貌。就原子力顯微鏡而言，其反饋到中央控制系統的參數是探針與樣品間的相互作用力，因此，可以更容易地獲得樣品的力學參數。

原子力顯微鏡樣品制備相對簡單，對樣品損傷小，無需進行染色、包埋等復雜處理過程，對測試環境要求不高，在空氣和液態環境下都可以進行測試，可用于表征普通材料樣品和生物樣品[1，2]，例如 DNA、蛋白質和活性細胞[3-6]。相對于光學顯微鏡，原子力顯微鏡可以有更好的分辨率。

實際掃描的過程中，原子力顯微鏡的成像圖是原子力探針和樣品共同卷積的結果，所以探針的選擇、樣品的制備直接決定成像質量。

1 探針對原子力顯微鏡的成像的影響

在掃描樣品表面時，探針的微小針尖與樣品表面相互作用，使探針的微懸臂發生形變。由激光二極管發出的激光束照射在探針的微懸臂末端，當微懸臂發生形變時，激光束的反射光束也發生相應的變化，通過四象限光電探測器接收反射后的激光束，對所獲得的信息進行轉換、放大，輸出電壓檢測信號。計算機通過比較檢測信號和預先設置的參考信號來實時調整壓電陶瓷掃描器在Z 軸方向上的伸縮量，實現反饋控制。計算機通過軟件編程對檢測信號進行處理，獲取樣品表面形貌圖像以及相應的物理量[7]。

探針[8]分基底(Substrate)、懸臂(Cantilever)和針尖(Tip)三部分。懸臂相當于力傳感器，根據懸臂形狀，探針可分為矩形懸臂和三角形懸臂。探針質量好壞以及探針參數會直接影響最后的成像。選擇探針不是由哪種掃描模式決定，實驗中要根據探針的參數去選擇。選擇探針的基本原則是：懸臂的軟硬度要適中，既保證樣品要產生足夠的形變量，又要保證有足夠的探測靈敏度。

1.1 彈性系數(k)

不同模式[9]下，應選擇不同彈性系數的針。以布魯克原子力顯微鏡為例，智能成像模式基于peakforce tapping mode，探針以正弦驅動方式離開和接近表面。我們要確保探針敲到表面之后可以離開，因為樣品表面有粘附力的影響，如果探針太軟，樣品粘附力比較大，探針形變比較大，樣品會拽著探針不讓離開，可能掃描器把探針拉到最高點的時候還沒分開，一般選擇彈性系數小于1N/m的探針就可以。

Tapping mode振幅比較小，一般在幾個nm到幾十個nm，克服粘附力是完全要依靠蘊藏在探針里的能量來離開樣品表面。彈性系數k越小，懸臂里的能量越小，越不容易離開樣品表面。Tapping振幅又小，所以要求探針的k要大，一般要選擇k大于2N/m的針。

接觸模式是探針直接壓到樣品表面來回劃，力越大越容易破壞樣品，所以盡量選擇k小的探針來做成像，太硬的針會劃傷樣品表面。同時我們應參考樣品的彈性模量大小來選擇探針。

1.2 曲率半徑(tip radius)

AFM有橫向分辨率和縱向分辨率，決定它們的因素不一樣。曲率半徑主要影響AFM的橫向分辨率，一般情況下，曲率半徑越小，針尖越尖，橫向分辨率越高。探針尖端尖不尖，用鈍針和尖針得到的效果是完全不一樣的，如圖1，同一個樣品，如果選擇曲率半徑小的尖針成像(圖1 b)，針尖可以更好地插入樣品，得到更高分辨率的成像。

圖1 鈍針(a)和尖針(b)的成像

1.3 懸臂鍍層

懸臂是AFM力的傳感器，所以它非常重要，控制力其實就是控制懸臂的彎曲量。探針背面的鍍層會增加懸臂反射率，提高信噪比。鍍層一般會選擇金、鋁等材質，帶鍍層的針sum值位于4.0～7.5V，不帶鍍層的針sum值位于1.5～2.5V。鍍層的質量也會影響到成像質量，成像有干涉條紋出現，一般情況是由于光調偏了，會有光漏出，也有可能是鍍層質量有問題。實驗中激光位置應該在懸臂前半部分，找sum值最大的位置。

大部分情況下，應該選背面有鍍層的針來做成像，特別是做peakforce tapping時。變溫實驗時要選擇不帶鍍層的懸臂，因為懸臂和鍍層材料不一樣，溫度變化時熱膨脹系數不一樣，懸臂會變彎，vertical一直在飄，所以變溫實驗時要避免選擇帶鍍層的針。

1.4 Deflection sensitivity

Deflection sensitivity代表垂直形變量的靈敏度，這個值很重要，在做力學實驗中首先要校準Deflection sensitivity。數越小，探測小的形變量的sensitivity越高，因此如果要測量特別小的形變量時，我們應該選擇Deflection sensitivity數比較小的探針。因為Deflection sensitivity跟懸臂的長度成正比，跟光路的長度成反比，因此要選懸臂短一些的針。

1.5 假象的問題

針尖形狀會影響到橫向分辨率，掃描的過程中會經常遇到兩種情況，一是探針被污染了，粘上東西了，相當于探針的形狀有變化，還有一種情況是，在做成像的過程中，因為力的原因逐漸把探針磨鈍了，相當于探針的形狀有了變化，所以分辨率會有變化。這兩種情況下，所測得結果卷積了探針形狀的改變，成像不真實，因此實驗中需要排除可能存在的這些假象，如圖2。

圖2 探針被污染或者變鈍的成像

2 樣品對原子力顯微鏡的成像的影響

2.1 樣品制樣

AFM樣品制樣原則，一要求基底干凈，二樣品要固定在基底上，如果樣品固定不好，或者樣品表面起伏太大，會導致力曲線很不穩定。常用的固定方法有四種：一是范德華力，可以用膠將樣品粘在基底上，大多數情況下可以選雙面膠，導電實驗時用銀膠；二是用化學鍵固定，比如表面修飾，經常用到的化學鍵是金硫鍵，硫醇的巰基在外面，固定到金的表面；三是酰胺鍵，在羥基或者氨基表面，樣品用氨基或者羥基結尾，形成酰胺鍵；還有一種是用靜電力，利用樣品和基底表面的電荷，比如很多DNA是帶負電荷[10]的，要把基底表面修飾成帶正電荷的，通過靜電作用固定樣品如圖3，基底修飾后的成像分辨率明顯提高很多。

圖3 云母基底修飾前后的成像圖a.修飾前；b.修飾后

最常用的基底是云母片，云母基底非常好用，每一層都是原子級平整的，不需要額外清理、清洗，前提是要選用高質量的云母。第二種基底是石墨，也是原子級平整，這兩種基底一個是親水，一個是疏水，在原子力的實驗中應用比較多，處理比較簡單。

2.2 樣品的安裝

安裝樣品時不要引入太多噪聲，如果樣品大于樣品臺，安裝樣品時會引起樣品臺邊緣震動，噪聲會比較高，甚至會覆蓋樣品本身的信號。

2.3 樣品帶電問題

同樣的樣品在不同的帶電條件下，測出來的結果不同。如果用tapping mode來做成像，一定要排除靜電影響。原因是tapping mode是通過振幅來成像，但如果樣品和探針之間有額外的靜電作用力的話，會引起探針共振峰的移動，即使高度沒有變化，引入額外的靜電力也會導致振幅變化，tapping將所有的振幅變化都反映在高度里邊，所以額外的靜電力會對高度有貢獻。這時雖然看到的圖很漂亮，但結果是錯誤的。

2.4 樣品污染的問題。

實驗中可能會遇到這種情況，本來很細膩的顆粒，成像突然變得很大，很顯然是探針被污染了，污染的東西掉下來之后又可以繼續掃，如果是peakforce QNM，可以根據粘附力變化來判斷樣品是否被污染。

2.5 樣品老化的問題。

有些樣品容易老化，不能放置時間太久，一定要新制的樣品才可以檢測，空氣中放置后就會無法檢測。

3 總結

原子力顯微鏡是一種納米級測量分析儀器，儀器非常靈敏，影響因素較多，大致包括探針、樣品、AFM成像系統、軟件設置以及人為的參數調節等幾大類。本文總結了探針的彈性系數、曲率半徑、懸臂鍍層對成像的影響，以及制樣、裝樣時可能存在的問題，實驗中為獲得更準確的成像，我們需要盡量克服樣品可能存在的這些問題，并選擇最優的探針來對其成像。