氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定富勒烯中痕量苯殘留

錢 沖 胡光輝,2 勾新磊 劉偉麗,2 高 峽,2 張 梅,2*

(1. 北京市理化分析測試中心，有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室北京 100089；2.北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100089)

作為碳的一種同素異形體，富勒烯是由五邊形和六邊形組成的籠狀結構全碳分子[1]。C60、C70富勒烯是最為常見的種類，也是理化性質最穩定、研究最為廣泛的兩種富勒烯。其中，C60是最小的遵守獨立五元環規則的富勒烯，具有類似足球一樣完美對稱的結構，其合成產率也最高[2]。大量的研究發現，富勒烯材料在超導、磁性、光學、催化、生物等方面表現出優異的性能，并已在生物醫藥、新能源、新材料等領域得到越來越廣泛的應用[3-7]。特別是富勒烯分子獨特的π電子結構以及低電子重組能、高電子遷移率等，使其成為醫學診斷及治療等生物醫學領域重要的功能原材料。

經過三十余年的發展，富勒烯的合成方法日益完善，包括火焰燃燒法、電弧放電法、石墨電阻蒸發法、激光蒸發法等[8, 9]，各種方法的工藝條件不一樣，產量和純度等也不盡相同。絕大多數方法合成的初產物為C60、C70等多種富勒烯與其副產物的碳灰混合物，成分非常復雜，由于不同富勒烯彼此間的分子結構、理化性質十分相似，如何對富勒烯的碳灰產物進行高效提取和分離是影響富勒烯發展的重要技術挑戰。只有將合成的富勒烯進行有效提取和分離，才能進一步對其獨特的結構和性質進行深入研究，為進一步拓展富勒烯的應用提供基礎[10-12]。

在富勒烯的分離、提取及改性研究中，芳香苯類化合物是最為常用的有機溶劑，特別是苯作為芳香族有機溶劑的典型代表被廣泛使用。由于苯環的結構與富勒烯較為相似，苯在富勒烯的分離提取過程中難以被完全去除，這導致其在最終的富勒烯產品中不可避免地殘留。然而，作為一類致癌物，苯的毒性較大，會對人體的呼吸系統、神經系統、血液系統造成損害，并影響人體的造血和免疫機能，嚴重威脅人類生命健康[13]。因此，對富勒烯中苯殘留進行有效分析與監測是保障產品安全性能的必要手段，對推動富勒烯在更多領域的應用具有重要意義。

目前，關于苯殘留檢測的相關研究主要集中在化工、環境、食品等領域[14-16]，而關于富勒烯中苯殘留的分析方法還鮮有文獻報道。氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)是苯殘留檢測最常用的方法[17,18]，這兩種方法的缺點在于靈敏度較低、受基質干擾影響大，易出現假陽性結果。相比而言，氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法(GC-MS/MS)通過二次打碎母離子，生成特異性更強的子離子，能夠在很大程度上提高檢測方法的靈敏度、降低基質干擾，有效避免假陽性結果的出現[19,20]，這也為富勒烯中苯殘留的分析提供了可能。本研究選取靈敏度高且基質效應小的GC-MS/MS法，建立了測定C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的分析方法，并開展了相關方法學驗證實驗。研究結果將為富勒烯中其它溶劑殘留的檢測技術提供借鑒，為富勒烯的應用特別是藥物臨床前的質量評價提供重要技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(GCMS-TQ8040)，GCMSsolution 4.30工作站，日本Shimadzu公司；渦旋混合器(Vortex-genie 2)，美國Scientific Industries公司；超聲清洗器(KQ-300DE)，中國昆山舒美公司；電子天平(XPE105)，瑞士Mettler Toledo公司；甲醇(色譜純)，美國Thermo Fisher Scientific公司；苯標準品溶液(1000 μg/mL)，美國Accustandard公司；C60富勒烯(批號：SES60F2018020203)、C70富勒烯(批號：SES70F2017073104)，由中科院化學所提供，用于方法學驗證；其它C60、C70富勒烯樣品均購自市場。

1.2 標準溶液配制

取濃度為1000 μg/mL苯標準品溶液適量，用甲醇將其逐級稀釋至濃度分別為3.00、10.00、20.00、40.00、200.00、400.00 μg/L的標準溶液，現用現配。

1.3 儀器工作條件

GC條件：DB-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250℃；載氣為He。進樣量1.0 μL，分流比5:1，柱流量1.0 mL/min。升溫程序：初始柱溫在50 ℃保持1 min，經20 ℃/min升至100 ℃，之后30 ℃/min升至280 ℃并保持2 min。

MS/MS條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃，溶劑延遲時間0.5 min，采用多重反應監測模式(MRM)。保留時間和MRM條件參數見表1所示。

表1 苯保留時間及MRM條件參數

1.4 樣品處理

稱取C60、C70富勒烯樣品100 mg置于2 mL離心管中，加甲醇1 mL，渦旋震蕩混勻后，置于超聲清洗器中超聲提取40 min并搖勻，經0.22 μm濾膜過濾。取濾液作為供試品溶液，按照儀器工作條件對其進行測定。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

圖1為苯和甲醇的標準質譜圖。苯的一級特征碎片離子(母離子)質荷比較小，因此提取溶劑的選擇應具備以下條件：首先能夠與苯互溶，苯在其中應有良好溶解度，以保證富勒烯中痕量苯殘留可以被提取完全；其次分子量不宜過大，若提取溶劑的分子量太大，其母離子及相應的子離子會干擾苯的測定。

圖1 苯(a)和甲醇(b)標準質譜圖

甲醇是常用的分子量最小的有機提取溶劑，并且與苯有良好互溶性，其最大母離子的質荷比為32 m/z，很難再二次打碎生成相應子離子，不會對苯的檢測造成干擾。因此，實驗選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2 色譜及質譜條件的選擇

為縮短檢測周期，本實驗僅在初始柱溫50 ℃下保持了1 min，便以20 ℃/min的速度升值100 ℃。當柱溫達到該溫度時，苯已出峰完全，此時繼續提高升溫速率，以30 ℃/min的快速升值280 ℃，并在該溫度下保持了2 min。這不僅減少了程序升溫的時間、提高了檢測效率，同時還達到了老化色譜柱的效果。

實驗選擇苯的質核比較大的一級特征碎片離子78和77 m/z作為母離子，進行碰撞能優化，并選擇豐度較高、質核比較大的子離子進行定性與定量分析。如表1所示，實驗選擇78.00>52.10 m/z作為定量分析離子對，選擇77.00>51.10 m/z和78.00>39.10 m/z作為定性分析離子對。

2.3 方法專屬性

針對方法的專屬性進行考察，按照試驗方法分別對甲醇空白溶劑、苯標準溶液(200 μg/L)、C60富勒烯供試品溶液(100 mg/mL)、C70富勒烯供試品溶液(100 mg/mL)進行檢測分析。

如圖2和圖3所示，實驗結果表明苯的色譜峰型及響應性均良好，甲醇、樣品中其它成分未對苯的檢測造成干擾。這表明本分析方法具有良好的專屬性，可以滿足C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的檢測要求。

圖2 甲醇空白溶劑(a)和苯標準溶液(b)選擇離子流圖

圖3 C60(a)和C70(b)富勒烯供試品溶液選擇離子流圖

2.4 檢出限、定量限和線性范圍

按照試驗方法對標準溶液系列進行測定，分別以苯定量離子對78.00>52.10 m/z峰面積(y)和對應的濃度(x，μg/L)進行線性回歸計算，得到線性回歸方程和線性相關系數。分別以10倍信噪比(S/N>10)和3倍信噪比(S/N>3)計算出儀器的的定量限和檢出限，再按1.4樣品的處理方式換算出苯的方法定量限與方法檢出限。

分析結果如表2和圖4所示，苯在3～400 μg/L濃度范圍內表現出良好的線性關系，線性相關系數(r2)為0.9999，方法檢出限和定量限分別為9.00 μg/kg、30.00 μg/kg。

表2 苯的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

圖4 苯的標準曲線

2.5 超聲提取時間的選擇

分別稱取C60、C70富勒烯100 mg，置于2 mL離心管中，加入甲醇1 mL，渦旋震蕩混勻。分別平行制備7份，置于超聲清洗器中，分別超聲提取0、5、10、20、40、60、90 min后搖勻，并經0.22 μm濾膜過濾，取濾液進行檢測分析。

表3為C60、C70富勒烯分別經不同超聲時間提取后苯含量的檢測結果。實驗結果表明，C60富勒烯超聲時間小于10 min時未檢出苯；超聲時間為20 min時，苯含量為6.58 μg/kg，小于方法檢出限9.00 μg/kg；超聲時間為40min時，苯含量為48.31 μg/kg；當超聲時間大于40 min時，苯的檢測結果趨于穩定。

表3 超聲提取時間優化結果 苯含量，μg/kg

對于C70富勒烯，當其超聲時間小于40 min時，隨著超聲時間的延長，苯的檢測結果呈逐漸增加趨勢；當超聲提取時間大于40 min時，苯的檢測結果也趨于穩定。因此，本方法優選的C60、C70富勒烯的超聲提取時間為40min。

2.6 系統適應性

實驗配制濃度200.00 μg/L的苯標準溶液，連續測定6次，以苯定量離子對78.00>52.10 m/z峰面積的RSD%值來考察方法的系統適應性。實驗結果見表4所示，苯標準溶液連續六次測得峰面積的RSD%值為0.95%，表明方法具有良好的系統適應性。

表4 系統適應性試驗結果(n=6)

2.7 重復性和中間精密度

實驗配制C60、C70富勒烯供試品溶液，分別平行配制6份，并按照試驗方法進行檢測分析，重復性試驗結果如表5所示。C60、C70富勒烯6次檢測結果的平均值分別為48.34 μg/kg和750.04 μg/kg，對應的RSD%值分別為4.81%、1.35%。

表5 重復性試驗結果(n=6)

此外，實驗進一步考察了不同時間、不同實驗人員在同一臺儀器上的數據重復性，通過重復上述試驗步驟，并以苯6次檢測結果與重復性項進行比較。以苯12次測得含量的RSD%值考察方法的中間精密度，結果見表6所示。C60、C70富勒烯中苯殘留的12次檢測結果的平均值分別為48.28 μg/kg和750.26 μg/kg，對應的RSD%值分別為4.48%、1.25%。

表6 中間精密度試驗結果(n=12)

2.8 加標回收率

實驗配制苯濃度分別為160.00、200.00、240.00 μg/L的標準溶液，分別稱取C60、C70富勒烯100 mg，置于2 mL離心管中。分別加上述配制的標準溶液1 mL，渦旋震蕩混勻后，超聲提取40分鐘并搖勻，經0.22 μm濾膜過濾。取濾液作為加標回收樣品溶液，配制成加標濃度分別為1600.00、2000.00、2400.00 μg/kg的低、中、高濃度的加標回收樣品溶液，每個加標濃度平行配制6份進行檢測分析。

以2.7小節重復性項中C60、C70富勒烯苯殘留檢測結果的平均值(分別為48.34 μg/kg和750.04 μg/kg)作為本底值，再根據標準曲線實際測得加標回收樣品的結果與理論添加量的比，計算加標回收率和RSD%值。實驗結果見表7所示，苯不同濃度加標回收率在94.39%～96.45%之間，對應的RSD%值在1.15%～1.41%之間。

表7 加標回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品分析

從市場采購了3種C60富勒烯和2種C70富勒烯樣品，按照本試驗方法對其中的苯殘留量進行分析測定。檢測結果如表8所示，市售的C60、C70樣品中均未檢測出苯，苯殘留量均低于方法檢出限9.00 μg/kg。

表8 市售C60、C70富勒烯樣品的檢測結果

3 結論

C60和C70富勒烯理化性質穩定、產率高，被廣泛應用于化工、生物醫學、化妝品等眾多領域。目前，藥物分析中對苯的殘留量有明確的限量規定，關于富勒烯作為最有潛力的藥物材料之一，其中苯殘留的分析方法尚鮮有報道，亟需明確并建立C60、C70富勒烯中苯殘留的分析測試方法。本工作探索并建立了基于GC-MS/MS測定C60、C70富勒烯中痕量苯殘留的方法，并系統開展了相關方法學驗證。研究結果表明，該方法的選擇性好、靈敏度高、分析速度快，并且操作便捷、檢測成本低，可廣泛應用于C60、C70富勒烯樣品中痕量苯殘留的定量及定性檢測。研究結果將有助于指導富勒烯中其它殘留組分的測定，對富勒烯的應用推廣特別是藥物臨床前的質量評價具有重要意義