氣相色譜-質(zhì)譜法檢測藥物中3種苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)

董海峰 湯 樺 楊俊免 張煜玲 李 彪*

(1.石家莊四藥有限公司藥物研究院，河北省大容量注射劑工程技術(shù)研究中心，注射給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，石家莊 050000；2.中國計量科學(xué)研究院化學(xué)計量與分析科學(xué)研究所，北京100013)

基因毒性雜質(zhì)是指能引起遺傳毒性的雜質(zhì)，包括致突變性雜質(zhì)和其他類型的無致突變性雜質(zhì)[1]。其研究起源于歐洲發(fā)生的維拉賽特(甲磺酸奈非那韋)事件，歐洲藥政管理部門要求所有相關(guān)的上市許可持有人對在他們的藥品中是否會出現(xiàn)這些雜質(zhì)開展風(fēng)險評估。歐洲藥品評估局，人用藥品委員會(CHMP)推出《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》[2]，引入了可接受風(fēng)險的攝入量，即毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)這個概念。根據(jù)此閾值，按照每日預(yù)期的攝入量去計算出該活性藥物中能夠接受的雜質(zhì)水平。苯磺酸左旋氨氯地平為二氫吡啶類長效鈣離子拮抗劑，具有鈣通道阻滯劑的特性。其對于治理高血壓有效果顯著，持久性好，副作用低等特點(diǎn)[3-5]，作為處方藥廣泛用于治療高血壓病和心絞痛病。由于苯磺酸左旋氨氯地平原料中含有的苯磺酸可能會與原料中殘留的醇類發(fā)生反應(yīng)生成苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)[6]，而根據(jù)ICH M7[7]指導(dǎo)原則，需要對苯磺酸左旋氨氯地平中潛在的苯磺酸甲酯(Methyl Benzenesulfonate, MBS)、苯磺酸乙酯(Ethyl Benzenesulfonate, EBS)、苯磺酸異丙酯(Isopropyl Benzenesulfonate, IBS) 進(jìn)行研究控制。目前苯磺酸酯類物質(zhì)的檢測方法報道較少，已報道的檢測方法有HPLC-UV法[8-10]，LC/MS法[11]，SPME-GC/MS法[12]等。但以上方法存在基質(zhì)干擾，適用范圍受限，靈敏度不佳等不足之處。本實驗以苯磺酸左旋氨氯地平片為例，建立藥物中苯磺酸酯類物質(zhì)衍生HS-GC/MS的檢測方法。該方法使用碘化鈉對苯磺酸酯類物質(zhì)進(jìn)行衍生生成碘代烷，衍生法與直接進(jìn)樣法相比較，靈敏度有較大的提高，檢測限值遠(yuǎn)低于限度要求，可靈敏準(zhǔn)確的檢測苯磺酸酯化合物；與萃取法相比，頂空法具有選擇性強(qiáng)，基質(zhì)干擾小等特點(diǎn)。該方法可以滿足藥物(苯磺酸左旋氨氯地平片)中3種苯磺酸酯類物質(zhì)的檢測監(jiān)控工作。

1 儀器與試藥

7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司)；TurboMatrix 40全自動頂空儀(珀金埃爾默公司)；XS-205電子天平(d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒公司)；Milli-Q純水機(jī)(Merck millipore公司)。

苯磺酸甲酯(純度>98.0 %)采購于TCI公司；苯磺酸乙酯(純度>98.0 %)采購于TCI公司；苯磺酸異丙酯(純度>97.0 %)采購于阿拉丁公司；甲磺酸丁酯(純度98.5 %)采購于百靈威公司；碘化鈉(純度 99.0 %)采購于百靈威公司；無水硫代硫酸鈉(純度99.0 %)采購于阿法埃莎公司；乙腈(色譜級)采購于默克公司；甲苯(色譜級)采購于默克公司。

2 方法

2.1 溶液制備

稀釋劑：將適量的水和乙腈按照20∶80(體積比)配制成混合溶液。現(xiàn)配現(xiàn)用。

衍生試劑：稱取60 g碘化鈉和30 mg無水硫代硫酸鈉，置于同一50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

內(nèi)標(biāo)溶液：量取10μL甲磺酸丁酯，置于10 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度線，搖勻；另精密量取此液0.4 mL于2000 mL稀釋劑中，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

對照品母液：精密稱取苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯對照品約10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲苯溶液溶解，并稀釋至刻度線，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

混合對照品貯備液：精密量取各對照品母液0.5 mL，置于100 mL容量瓶，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度線，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

混合對照品溶液：精確量取混合對照品貯備液0.5 mL，置于10 mL容量瓶，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

定量限溶液：量取對照品母液適量分別置于100 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻；另取上述各溶液適量置于100 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，配制得到每毫升溶液中含苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯分別為3.57 ng、4.61 ng、6.13 ng。現(xiàn)配現(xiàn)用。

線性對照品溶液：分別量取混合對照品貯備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL分別置于10 mL容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度線，搖勻，即得。現(xiàn)配現(xiàn)用。

準(zhǔn)確性樣品制備：稱取25 mg供試品于20 mL頂空瓶中，分別添加3個濃度水平(1.00、4.00、6.00 mg·kg-1)的混合對照品溶液各3份，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，0.5 mL衍生溶液，立即加蓋密封，立即檢測。現(xiàn)配現(xiàn)用。

對照品溶液制備：準(zhǔn)確移取混合對照品溶液0.5 mL，置于20 mL頂空瓶中加入0.5 mL衍生溶液，立即加蓋密封，立即檢測。

供試品制備：取供試品于研缽中研磨，稱取粉末約25.00 mg，精密稱定，置于20 mL頂空瓶中，加0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，0.5 mL衍生溶液，立即加蓋密封，立即檢測。供試品為苯磺酸左旋氨氯地平片，由石家莊四藥有限公司提供。

2.2 分析條件

頂空條件：加熱爐溫度：60 ℃；平衡時間：30 min；取樣針溫度：80 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；進(jìn)樣時間：0.02 min。

氣相色譜條件：色譜柱：VF-WAXms毛細(xì)管柱 (30 m×0.25 mm×1.0 μm)；載氣：He(純度99.999 %)；柱流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣(20∶1)；柱箱溫度：初始40 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升至140 ℃，保持0 min；后運(yùn)行：230 ℃，保持8 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度：220 ℃；四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；離子檢測方式：選擇離子掃描(SIM)模式；苯磺酸甲酯(BSM)、苯磺酸乙酯(BSE)、苯磺酸異丙酯(IMS)、甲磺酸正丁酯(BMS)，經(jīng)衍生后依次得到碘甲烷(Mel)、碘乙烷(Etl)、碘異丙烷(iPrl)、碘正丁烷(Bul)。4種分析化合物(BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl、BMS-Bul)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種分析化合物質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了色譜柱(DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-624(30 m×0.25 mm×1.4 μm)、VF-WAXms(30 m×0.25 mm×1.0 μm)、柱流速(0.5、0.8、1.0 mL·min-1)、進(jìn)樣時間(0.01、0.02、0.03 min)對實驗結(jié)果的影響，考察了4種分析化合物(BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl、BMS-Bul)的分離效果及響應(yīng)情況，確定最優(yōu)的色譜條件。圖1為空白溶液、苯磺酸左旋氨氯地平及混合對照品溶液的色譜圖。色譜柱對比發(fā)現(xiàn)， DB-5MS、 DB-624色譜柱的固定相極性較弱，對4種分析化合物保留性較差，VF-WAXms屬于極性氣相色譜柱對4種分析化合物具有較好的保留性和分離度。4種分析化合物隨著柱流速的增加，響應(yīng)呈現(xiàn)上升趨勢，而隨著進(jìn)樣時間的增加，在0.02min后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。綜合考慮，最優(yōu)的柱流速和進(jìn)樣時間分別為0.8 mL·min-1和0.02 min。在最優(yōu)的檢測條件下，苯磺酸左旋氨氯地平對4種分析化合物檢測無干擾且響應(yīng)較好。圖1為空白溶液、苯磺酸左旋氨氯地平及混合對照品溶液的色譜圖。

圖1 優(yōu)化的HS-GC/MS條件下樣品溶液色譜圖

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 靈敏度、定量范圍及線性方程

采用3倍信噪比對應(yīng)濃度為檢出限，10倍信噪比為定量限。苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯的檢出限(LODs)及定量限(LOQs)見表2。配制6份定量溶液，并連續(xù)進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，各成分檢測限、定量限均能滿足檢測要求(限量要求：150 ng·mL-1)，并且該方法在定量限濃度具有較好的重復(fù)性。

表2 3種苯磺酸酯化合物的檢測限和定量限

表3 3種苯磺酸酯化合物定量限的重復(fù)性(n=6)

取線性對照品溶液和定量限溶液經(jīng)HS-GC/MS分析檢測，以對照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，相對響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種苯磺酸酯化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見表4。結(jié)果顯示，3種苯磺酸酯化合物線性關(guān)系良好，適合定量分析。

表4 3種苯磺酸酯化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

3.2.2 精密度和重復(fù)性

配制6份對照品溶液，連續(xù)檢測。計算各組分相對響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察日內(nèi)精密度(編號1-6)。選取與日內(nèi)精密度不同的檢測日期對混合對照品溶液重復(fù)以上檢測過程，計算各組分兩次檢測相對響應(yīng)值的RSD，考察日間精密度(編號：1-12)。結(jié)果見圖2，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差(n=6,12)。結(jié)果顯示，3種苯磺酸酯化合物日內(nèi)精密度(n=6)的RSD在1.06%～1.82%之間；日間精密度(n=12)的RSD在0.83%～2.73%之間。該方法精密度良好。

圖2 3種苯磺酸酯化合物的日內(nèi)精密度(n=6)和日間精密度(n=12)

配制6份供試品樣品，經(jīng)HS-GC/MS分析檢測，計算各組分相對響應(yīng)值的RSD，考察重復(fù)性。結(jié)果顯示，6份供試品樣品中均未檢出BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl。本方法檢測重復(fù)性良好。

3.2.3 準(zhǔn)確性

在苯磺酸左旋氨氯地平片中分別添加3個濃度水平(1.00、4.00、6.00 mg·kg-1)的混合對照品溶液各3份。計算3種苯磺酸酯化合物的加樣回收率，考察方法準(zhǔn)確度。結(jié)果見圖3，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。9份樣品BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl的平均回收率(RSD)分別為109.89%(1.83%)、106.13%(3.87%)、103.32%(1.62%)。結(jié)果顯示，該方法準(zhǔn)確度良好。

圖3 3種苯磺酸酯化合物的準(zhǔn)確度(n=9)

3.2.4 耐用性

通過微調(diào)色譜條件，考察各組分相對響應(yīng)值的變化。調(diào)整色譜條件：升溫速率12 ℃·min-1和8 ℃·min-1，柱流量0.85 mL·min-1和0.75 mL·min-1，起始溫度42 ℃和38 ℃，加熱爐溫62 ℃和58 ℃，保溫時間32 min和28 min。結(jié)果見圖4，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差(n=11)。共計11種不同檢測條件下，3種苯磺酸酯化合物的RSD在3.96%～6.59%之間。結(jié)果顯示，各組分之間分離效果良好，且對定量檢測無影響，該方法耐用性良好。

圖4 3種苯磺酸酯化合物的耐用性(n=11)

4 結(jié)論

建立的頂空-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法，以甲磺酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，頂空瓶內(nèi)衍生，檢測苯磺酸左旋氨氯地平中3種苯磺酸酯化合物。方法學(xué)研究證明，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，線性關(guān)系良好，同時具有良好的精密度和耐用性，適用于藥物中苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的檢測，可作為其質(zhì)量監(jiān)控的依據(jù)。