椰子水多糖的結構和體外生物學活性分析

張玉鋒 ，郭玉如，溫遠芬，宋菲，張有林*

1. 中國熱帶農業科學院椰子研究所，國家重要熱帶作物工程技術中心（椰子研發部），海南省椰子深加工工程技術研究中心（文昌 571339）；2. 陜西師范大學食品工程與營養科學學院（西安 710119）；3. 山西師范大學食品科學學院（臨汾 041004）

椰子（Cocos nuciferaL.）因其在食品、能源、化工、建材等領域的廣泛應用，被熱區人民稱為“生命之樹”[1]。尤其是近來年，隨著椰子及其產品在預防和治療帕金森氏癥、心血管疾病、糖尿病和高血壓等疾病方面研究報道的增多[2]，世界范圍內的椰子產品需求也逐年增長。這也就意味著越來越多的副產物，如椰子水、椰殼、椰蓉的大量產生。據不完全統計，海南省作為我國椰子主產區，年加工椰子超25億個，椰子水年產量超62.5萬 t[3]。這些椰子水除了少量用于發酵“納塔”外，大部分被丟棄到土壤或海洋中，不僅浪費資源，也存在很大的環境污染風險。

研究表明，椰子水富含糖、維生素和礦物質，營養價值較高，是一種天然電解質飲料[4-5]。同時，椰子水還被證實具有降血壓、降血脂、心臟保護、降血糖和肝保護等功效[6-7]，但是關于椰子水發揮功效的具體物質基礎尚不清楚。此外，植物多糖因來源廣泛、活性突出等特點成為近年來食品和醫藥領域的研究熱點[8-10]。關于椰子水多糖結構及功能活性相關的研究尚未見諸報道。因此，試驗以椰子水為原料，提取制備多糖，分析其結構特征，并評價其體外生物學活性，為椰子水在功能性食品和新藥資源領域的高值化利用提供數據支持，促進海南椰子產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮成熟椰子水（文昌東郊椰子加工廠）；巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸（均為色譜級，純度＞98%，美國Sigma公司）；DMEM高糖培養基（含10% FBS、1%青鏈霉素）、二甲雙胍、胰蛋白酶、葡萄糖測定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；過氧化氫、碳酸鈉、三氯乙酸、無水乙醇、硫酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等（均為分析純）。

UV-1600型紫外可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司]；DAWN HELEOS-II 18角度激光光散射儀（美國懷雅特公司）；Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾公司）；ICS-3000離子色譜儀（美國戴安公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 椰子水多糖的制備

采集后2 h內的新鮮椰子水用4層紗布過濾，濾液在4 000 r/min離心10 min除雜，上清液于45 ℃真空濃縮至原體積的1/10；向濃縮液中加入等體積5%三氯乙酸溶液，于4 ℃靜置24 h；按4 000 r/min離心20 min取上清液，加入4倍體積的95%乙醇于4 ℃沉淀24 h；按4 000 r/min離心15 min取沉淀真空冷凍干燥，得到椰子水多糖，密封于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 椰子水多糖的化學組成分析

椰子水多糖的主要化學成分包括中性糖、糖醛酸、蛋白質和總酚，它們的含量分別用蒽酮-硫酸法[11]、咔唑-硫酸法[12]、考馬斯亮藍法[13]和福林酚法[11]測定，分別以葡萄糖、半乳糖醛酸、牛血清蛋白和沒食子酸（GAE）為對照做標準曲線。

1.2.3 椰子水多糖的單糖組成

取10 mg樣品于水解管中，加入4.0 mL 4 mol/L三氟乙酸，充氮1 min排出管內空氣，旋緊螺旋蓋，于120 ℃水解2 h，待冷卻后氮氣吹干水解液，除去過量的三氟乙酸，加超純水定容至10 mL。稀釋20倍后用0.2 μm濾膜過濾后，取20 μL濾液分析單糖組成。

色譜條件：流動相A為水，流動相B為250.0 mmol/L氫氧化鈉，流動相C為1.0 mol/L乙酸鈉；流速0.5 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫35 ℃。

洗脫條件：0~20 min，94% A和6% B；20~20.1 min，89% A，6% B和5% C；20.1~35 min，74% A，6% B和20% C；35.1~45 min，20% A和80% B；45.1~55 min，94% A和6% B。

1.2.4 椰子水多糖的相對分子質量測定

配制1 mg/mL的樣品溶液，過0.22 μm濾膜后，用測定多糖的相對分子質量。

色譜條件：流動相0.1 mol/L氯化鈉，流速0.5 mL/min，上樣量200 μL，柱溫25 ℃。

1.2.5 傅里葉紅外光譜（FIIR）分析

將樣品粉末與KBr混勻，壓成薄片，波數范圍為4 000~400 cm?1。

1.2.6 椰子水多糖的體外抗氧化活性測定

DPPH、ABTS和羥自由基清除能力分別參考李春陽等[14]、Re[15]和莫開菊等[16]的方法測定，以抗壞血酸（VC）為陽性對照。亞鐵離子螯合能力參考Torresfuentes等[17]的方法測定，并以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）為陽性對照。

1.2.7 椰子水多糖對HepG2細胞活力及葡萄糖消耗的影響

參考王夢雅等[18]的方法測定，并稍作修改。復蘇后的HepG2細胞用含有5%胎牛血清的DMEM高糖培養基于37 ℃、5%的CO2培養箱培養，每隔3 d用0.25%胰酶消化傳代。傳代3次后取對數生長期細胞進行試驗。

1.2.7.1 細胞活力抑制率測定

取對數期細胞于96孔板，調整細胞密度為1×105個/孔，設置終濃度2，20和50 μg/mL的多糖樣品組、不加樣品的正常對照組和二甲雙胍組（終濃度1×10-6moL/L，約0.17 μg/mL），于37 ℃、5%的CO2培養箱培養24 h。棄上清液，每孔加入20 μL質量濃度5 mg/mL的MTT溶液，于培養箱中繼續培養4 h。棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），用槍頭吹吸均勻，15 min后測定570 nm處的吸光度。

1.2.7.2 葡萄糖消耗試驗

取對數期細胞于96孔板，調整細胞密度為1×105個/孔，設置濃度2，20和50 μg/mL的多糖樣品組；不加樣品的DEME培養液為正常對照組；二甲雙胍組（終濃度1×10-6moL/L，約0.17 μg/mL）為陽性對照組。在37 ℃、5%的CO2培養箱培養24 h后，按試劑盒說明書測定上清液中的葡萄糖含量。

1.3 數據分析

數據分析和圖表制作采用Office 2007和Origin 8.5軟件，部分數據以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 椰子水多糖的化學組成

化學成分結果顯示，椰子水多糖的中性糖含量達66.43%±1.78%，蛋白質僅0.31%，說明多糖是提取樣品的最主要成分。糖醛酸含量為21.50%±0.75%，略低于枇杷葉多糖（糖醛酸含量28.82%~39.09%），表明椰子水多糖中也可能存在果膠樣酸性多糖[19]。另外，經過除蛋白、乙醇沉淀和冷凍干燥等過程后，多糖中還結合有部分酚類物質（4.61 mg GAE/g），說明椰子水多糖中可能存在少量的多糖-多酚共軛物[19]。

表1 椰子水多糖的化學組成

圖1 椰子水多糖的單糖組成色譜圖

進一步利用離子色譜儀分析單糖組成后發現，椰子水多糖是一種雜多糖，主要由半乳糖、葡萄糖和木糖3種單糖組成，摩爾比為1.00∶10.30∶0.27。其中，葡萄糖為最主要單糖，1 mg/mL多糖水解液中的含量達194.40 μg/mL，其次為半乳糖（18.88 μg/mL）和阿拉伯糖（4.28 μg/mL）。未鑒定出半乳糖醛酸，推測椰子水多糖中可能含有其他糖醛酸組分，但仍需進一步驗證。

2.2 椰子水多糖的相對分子質量

高效凝膠滲透色譜顯示，椰子水多糖相對分子質量分布集中在主峰3（光散射檢測器下為2個色譜峰、示差信號中未完全分開）。但光散射信號顯示椰子水多糖由3個洗脫峰組成，而峰1和峰2在示差檢測器中幾乎檢測不出，可能為含量極少的高分子量聚集體[20]（圖2）。因此，為探究多糖與活性的構效關系，可分離純化多糖純品。

圖2 椰子水多糖的高效凝膠滲透色譜圖

利用ASTRA5.3.4軟件計算椰子水多糖洗脫峰3的參數，如表2所示，重均分子質量（MW）和數均分子質量（Mn）分別為1.96×103g/moL和5.32×102g/moL，表明椰子水多糖為小分子聚合物。就多分散系數（Mw/Mn）來講，Mw/Mn值等于1時說明其相對分子質量分布均勻；比值越大，則相對分子質量分布越寬[21]。也即椰子水多糖的相對分子質量分布較寬（Mw/Mn=3.68），這與高效凝膠滲透色譜中光散射檢測器的測定結果相吻合。

表2 椰子水多糖的分子參數

2.3 椰子水多糖的紅外光譜分析

紅外光譜顯示，椰子水多糖在3 200~3 400，2 800~3 000，1 400~1 600和800~1 200 cm-1有特征吸收峰。其中，3 288.52 cm-1代表O—H伸縮振動，2 898.91 cm-1代表C—H伸縮振動，而這2處吸收峰多為酸性多糖的特征吸收[22]；1 396.41 cm-1處的弱吸收進一步證明羰基的存在[23]，這與多糖中含有糖醛酸的結果相吻合。1 577.72 cm-1代表N—H的彎曲振動和[22]，說明多糖中含有蛋白質組分。1 000~1 200 cm-1的強吸收，說明有吡喃糖的存在，尤其是921.94 cm-1處可歸納為β-吡喃結構，829.36 cm-1則表示α-糖苷鍵的連接方式[24]。

圖3 椰子水多糖的紅外光譜

2.4 椰子水多糖的體外抗氧化活性

DPPH自由基是為數不多的穩定自由基之一，可直接反映抗氧化劑的供氫能力[25]。由圖4可知，椰子水多糖對DPPH清除能力在低濃度范圍（0~0.25 mg/mL）內隨濃度增加而增大，0.25 mg/mL時的清除率達67.72%，與5 μg/mL時VC的清除效果相當（72.70%）；但繼續增加多糖濃度（0.25~0.5 mg/mL），其清除能力則無明顯增加趨勢，可能是椰子水多糖中供氫基團含量較低的緣故。

圖4 椰子水多糖和維生素C對DPPH自由基的清除活性

羥自由基是已知的生物體內活性和毒性最強的活性氧之一，它可以攻擊脂類、蛋白質和核酸等幾乎所有的生物大分子，誘發氧化損傷[24-25]。椰子水多糖對羥自由基的清除能力呈劑量效應，7.5 mg/mL時清除率達95.13%（圖5），略優于Xu等[24]制備的黑醋栗多糖（對羥自由基的半清除濃度IC50為1.16 mg/mL），但仍弱于陽性對照VC（0.35 mg/mL時清除率達99.45%）。

圖5 椰子水多糖和維生素C對羥自由基的清除活性

椰子水多糖和VC對ABTS自由基的清除能力均呈線性關系（圖6），擬合優度（R2）均大于0.99。進一步計算可得到椰子水多糖對ABTS自由基清除的IC50為2.10 mg/mL，顯著低于VC（IC50為13.89 μg/mL）（p＜0.05），但高于Liu等[26]通過冷凍和熱風干燥制備的香菇酸性多糖（IC50分別為3.66 mg/mL和3.18 mg/mL）。這可能與椰子水多糖中含有較高的糖醛酸或多酚類物質有關[27]。

圖6 椰子水多糖和維生素C對ABTS自由基的清除活性

亞鐵離子參與生物體內的多個氧化還原反應，如催化H2O2通過哈珀-維斯（Haber Weiss）反應生成毒性更強的羥自由基，進一步導致機體損傷。因此，螯合金屬離子也是反映物質抗氧化能力的指標之一。椰子水多糖對亞鐵離子的螯合能力在測試濃度范圍內大致呈對數函數關系（R2=0.950 3），10 mg/mL時螯合率達89.74%。EDTA的螯合能力則表現為冪函數關系（R2=0.950 4），0.04 mg/mL時螯合率達94.93%。

圖7 椰子水多糖和EDTA對亞鐵離子的螯合能力

2.5 椰子水多糖對HepG2細胞活力及葡萄糖消耗的影響

圖8 椰子水多糖對HepG2葡萄糖消耗能力的影響

糖尿病作為一種慢性多發性疾病成為全球關注的公共衛生問題，尋求安全高效的降糖資源成為食品和醫藥界的研究熱點之一。為探究椰子水多糖的降糖潛力，探究其對正常HepG2細胞活力和葡萄糖消耗作用的影響。結果發現，在測試濃度（2，20和50 μg/mL）下，椰子水多糖對HepG2細胞活力均無抑制作用（結果未顯示）；并具有微弱的葡萄糖吸收促進作用，20 μg/mL時消耗率增加4.81%，低于0.17 μg/mL二甲雙胍的促吸收效果。

3 結論

試驗以椰子加工副產物為原料，制備椰子水多糖，并探究其化學組成、結構特征、體外抗氧化以及其對HepG2細胞活力和葡萄糖消耗率的影響。結果表明，椰子水多糖中含有大量的糖醛酸（21.50%），是一種含有β-吡喃環結構的酸性雜多糖。多糖分子的重均分子質量為1.96×103g/moL，含有葡萄糖、半乳糖和木糖3種單糖。該多糖具有一定的體外抗氧化活性，0.25 mg/mL時其對DPPH自由基的清除率達67.72%；2.5 mg/mL時其對ABTS和羥自由基的清除率分別為60.72%和61.38%。椰子水多糖還能螯合亞鐵離子，5 mg/mL時的螯合率達71.37%。對HepG2消耗葡萄糖也有些許促進作用，20 μg/mL時消耗率增加4.81%。研究結果為椰子水的深加工利用提供思路和借鑒。