超聲波輔助乳酸菌發(fā)酵制備核桃多肽工藝

賀瑩，馮談林，馮彩平

呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）

核桃屬于胡桃科植物，又稱羌桃，是世界著名“四大干果”之一[1]。核桃是山西呂梁的特色產(chǎn)品，且栽培歷史悠久。核桃果仁含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、鈣、磷、鐵等成分，對人體有益，營養(yǎng)價值一般較高。核桃仁不僅具有有效防止人體細(xì)胞快速老化、增強人體記憶力、健腦、延緩衰老的功效，同時還具有減少胃腸道對膽固醇消化吸收的作用以及順氣健脾補血、止咳清熱化痰、潤肺補腎等保健功能[2-3]。

以核桃粕為原料，采用超聲波輔助乳酸菌發(fā)酵酶解提取核桃里面的多肽，利用超聲波輔助發(fā)酵可提高發(fā)酵周期，所以試驗引進(jìn)超聲波技術(shù)[4-5]，以核桃多肽質(zhì)量濃度為指標(biāo)，選擇超聲功率、料液比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為單因素指標(biāo)，研究這些因素對核桃多肽工藝的影響，通過響應(yīng)面尋找更優(yōu)的制備方法，確定最適制備工藝條件，為核桃多肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考技術(shù)[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

核桃粕（市售）；還原性谷胱甘肽（貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司）；三氯乙酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；CuSO4（福州飛凈生物科技有限公司）；氫氧化鈉（無錫市亞太聯(lián)合化工有限公司）；MRS培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；乳酸菌發(fā)酵劑（北京川秀國際貿(mào)易有限公司）。

KQ-100KDB數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司）；XM-2500粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；TG16-W冷凍離心機（湖南湘儀）；N2S分光光度計（上海精科有限公司）；WT-1002電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；RZ0021標(biāo)準(zhǔn)篩（錦航儀器廠）；1250B生化培養(yǎng)箱（國華企業(yè)）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理[7-8]

將原料核桃粕粉碎后，過0.250 mm（60目）孔徑篩網(wǎng)，按單因素料液比加入相應(yīng)的蒸餾水，用高壓滅菌鍋在121 ℃下滅菌20 min，進(jìn)行冷卻處理。

1.2.2 核桃多肽的提取工藝

超聲波處理↘

核桃粕→粉碎后過篩→加蒸餾水→滅菌冷卻→接種乳酸菌→發(fā)酵→離心分離→測定核桃多肽質(zhì)量濃度

操作要點：將冷卻處理后的料液接種乳酸菌，玻璃棒攪拌混勻，紗布封口，放在生化培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵[9]，在恒溫發(fā)酵過程中加入超聲波技術(shù)輔助發(fā)酵制備核桃多肽，發(fā)酵完畢后，按照核桃多肽的測定方法進(jìn)行一系列處理，以3 000 r/min離心分離，在540 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算核桃多肽質(zhì)量濃度。

1.2.3 乳酸菌的菌種活化

將乳酸菌接種到已配好的固體生化培養(yǎng)基上，放于生化培養(yǎng)箱中在37 ℃下靜態(tài)放置，活化48 h，在超凈無菌工作臺上用接種環(huán)循環(huán)挑取少量菌體接入已滅菌消毒后的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度37 ℃、搖床應(yīng)在轉(zhuǎn)速180 r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行二次擴大培養(yǎng)，將無菌的液體培養(yǎng)基1 mL菌體接入100 mL液體培養(yǎng)基中，溫度37 ℃，搖床在轉(zhuǎn)速180 r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液備用[10]。

1.2.4 核桃多肽質(zhì)量濃度測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：用體積分?jǐn)?shù)5%的TCA溶液將還原型谷胱甘肽配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mg/mL的四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中充分定容，取6.0 mL上述四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4.0 mL雙縮脲試劑，充分?jǐn)嚢杌靹蜢o置10 min后，以3 000 r/min離心5 min，在540 nm波長處測定其吸光度，以6 mL的5%三氯乙酸溶液與4 mL雙縮脲試劑反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=0.377 5x+0.026 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 2，說明多肽質(zhì)量濃度在0.2~1.4 mg/mL的范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性回歸關(guān)系。

樣品中多肽的測定：準(zhǔn)確量取4 mL樣品溶液，同時加入4 mL 10%的TCA溶液，充分混勻靜置10 min，在3 000 r/min下離心10 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用5%的TCA溶液定容，充分振蕩搖勻，同樣取6.0 mL樣液，加入4.0 mL雙縮脲試劑，充分混勻后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液在540 nm波長處測定吸光度[11]。

1.2.5 單因素試驗

以核桃多肽質(zhì)量濃度為指標(biāo)，研究超聲功率、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間3個因素對核桃多肽提取量的影響[12-13]。

1.2.5.1 超聲功率對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

在料液比1∶1 g/mL、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間8 h條件下，探索不同超聲功率（50，100，150，200和250 W）對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.5.2 發(fā)酵溫度對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

在超聲功率100 W、料液比1∶1 g/mL、發(fā)酵時間8 h條件下，探索不同發(fā)酵溫度（35，37，40，43和45℃）對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響[14]。

1.2.5.3 發(fā)酵時間對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

在超聲功率100 W，料液比1∶1 g/mL，發(fā)酵溫度37 ℃條件下，研究不同提取時間（6，8，10，12和14 h）對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗

結(jié)合單因素試驗，選擇超聲功率（A），發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）3個因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，以核桃多肽質(zhì)量濃度（Y）為指標(biāo)，探索研究提取核桃多肽的最佳工藝參數(shù)[15]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

運用Origin繪圖軟件繪制各個單因素水平對核桃多肽濃度的影響趨勢圖，利用Design-Expert 8.0軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖1可以看出，在料液比1∶1 g/mL、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間8.0 h條件下，核桃多肽質(zhì)量濃度隨著超聲功率升高呈先增加后減少趨勢，發(fā)酵功率達(dá)到100 W時核桃多肽質(zhì)量濃度最高。隨著超聲功率繼續(xù)升高，核桃多肽的質(zhì)量濃度開始逐漸下降，所以試驗選取100 W為最適超聲功率。

圖1 超聲功率對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖2可以得出，在超聲功率100 W、料液比1∶1 g/mL和發(fā)酵時間8.0 h條件下，隨著發(fā)酵溫度升高，核桃多肽質(zhì)量濃度也隨之增加，發(fā)酵溫度40 ℃時，核桃多肽的質(zhì)量濃度達(dá)到最大，說明乳酸菌在該溫度下能夠較好地繁殖，發(fā)酵溫度達(dá)到40 ℃后，核桃多肽質(zhì)量濃度隨著發(fā)酵溫度升高而降低，說明溫度偏高不利于乳酸菌發(fā)酵，使核桃多肽的質(zhì)量濃度有所下降。因此，發(fā)酵溫度選擇40 ℃比較合適。

圖2 發(fā)酵溫度對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖3可以得出，在超聲功率100 W、料液比1∶1 g/mL和發(fā)酵溫度37 ℃條件下，隨著發(fā)酵時間的延長，核桃多肽質(zhì)量濃度明顯升高，提取時間10.0 h時，核桃多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最高。提取時間超過10.0 h時，核桃多肽質(zhì)量濃度開始下降，可能因為發(fā)酵時乳酸菌的生長繁殖需要大量營養(yǎng)物質(zhì)，隨著發(fā)酵時間延長，多肽和營養(yǎng)物質(zhì)被乳酸菌利用，導(dǎo)致多肽質(zhì)量濃度有所下降。故試驗選擇10.0 h為提取核桃多肽的最適發(fā)酵時間。

圖3 發(fā)酵時間對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

依據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取超聲功率、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為主要考察因素，以核桃多肽質(zhì)量濃度為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計和結(jié)果見表1和表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型分析

將響應(yīng)面試驗結(jié)果運用Design Expert 8.0進(jìn)行回歸分析，得到超聲功率（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）與核桃多肽質(zhì)量濃度（Y）的二次回歸模型：Y=2.86+0.073A-0.036B-0.021C+0.12AB+7.500E-003AC+0.075BC-0.25A2-0.20B2-0.28C2。各項系數(shù)絕對值的大小及正負(fù)分別表示各因素對核桃多肽質(zhì)量濃度影響程度的大小和各因素影響的方向，各因素對核桃多肽濃度的影響由大到小依次為A＞B＞C。

根據(jù)表3對回歸模型進(jìn)行方差分析，可以看出模型p=0.000 5＜0.01，該模型具有極顯著性；失擬項p=0.102 2＞0.05，說明在各因素水平范圍內(nèi)，此模型可用于進(jìn)行試驗結(jié)果分析和預(yù)測。同時由表3可知，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，一次項A以交互項AB對多肽濃度的影響達(dá)到顯著水平，一次項B、C對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響不顯著，二次項A2，B2及C2對該模型的影響極為顯著。

表3 回歸模型分析

2.2.3 因素間的交互作用分析

為研究超聲功率、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間兩兩之間的交互作用對多肽提取量影響程度的大小，由響應(yīng)面分析軟件得到圖4~圖6，反映各交互項對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響。其中，等高線圖的形狀能夠判斷出各因素間交互作用的顯著性，等高線呈橢圓表明因素間交互作用顯著，而呈圓形表明因素間交互作用不顯著。

由圖4可以得出，核桃多肽的質(zhì)量濃度等高線圖呈近似橢圓形，故超聲功率與發(fā)酵溫度的交互作用對提取核桃多肽的影響顯著，隨著制備過程中超聲功率增大、發(fā)酵溫度逐漸升高，核桃多肽質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先逐漸升高后降低趨勢。由圖5可知，等高線圖呈現(xiàn)近似圓形，說明超聲功率與發(fā)酵時間的交互作用對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響不顯著，隨著超聲功率增大、發(fā)酵時間延長，核桃多肽質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先逐漸升高然后降低趨勢。由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度不斷升高，核桃多肽質(zhì)量濃度先增加后減小；隨著發(fā)酵時間延長，核桃多肽的質(zhì)量濃度也呈現(xiàn)逐漸升高后下降趨勢。由此可知，各因素間交互作用與單因素對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響不一致，超聲功率與發(fā)酵溫度的交互作用對核桃多肽的質(zhì)量濃度影響顯著，其余2項交互項對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響不顯著。

圖5 超聲功率與發(fā)酵時間交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖6 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間交互作用的響應(yīng)面與等高線

2.2.4 最佳提取條件驗證

運用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行提取核桃多肽的工藝條件優(yōu)化，可得核桃多肽優(yōu)化提取的最佳試驗理論條件：超聲功率156.59 W，發(fā)酵溫度42.35 ℃，發(fā)酵時間9.91 h。此時提取的核桃多肽質(zhì)量濃度為2.868 mg/mL。依據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，為方便操作，將核桃多肽的提取工藝條件調(diào)整為超聲功率156 W，發(fā)酵溫度42.3 ℃，發(fā)酵時間9.9 h，通過3次平行試驗，得出該條件下核桃多肽的質(zhì)量濃度為2.88 mg/mL，與理論值差異不顯著，所以得到的回歸模型及最佳提取條件真實可靠。

3 結(jié)論

采用超聲波技術(shù)輔助乳酸菌發(fā)酵的方法制備核桃多肽，通過單因素試驗的設(shè)計，得到各因素對于核桃多肽質(zhì)量濃度的影響趨勢圖，根據(jù)趨勢圖，隨著超聲波功率、發(fā)酵溫度、發(fā)酵持續(xù)時間的升高和延長，核桃多肽的質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，確定料液比1∶1 g/mL、超聲波功率100~200 W、發(fā)酵溫度40~45 ℃、發(fā)酵時間8~12 h是最佳的工藝條件范圍，在此基礎(chǔ)上通過三因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化試驗，全面且直觀地設(shè)計和分析各因素對核桃多肽質(zhì)量濃度的影響，以及各因素之間的交互作用，建立回歸響應(yīng)模型，經(jīng)驗證該回歸模型合理可靠，核桃多肽的最佳提取工藝條件為超聲功率156 W、發(fā)酵溫度42.3 ℃，發(fā)酵時間9.9 h，試驗驗證，得到的核桃多肽的質(zhì)量濃度為2.88 mg/mL。