豬I型補(bǔ)體受體與C3b活性片段相互結(jié)合的體外檢測(cè)

孫雨晨，賈瑞璞，范闊海，孫娜，孫耀貴，孫盼盼，李宏全，尹偉

豬I型補(bǔ)體受體與C3b活性片段相互結(jié)合的體外檢測(cè)

孫雨晨，賈瑞璞，范闊海，孫娜，孫耀貴，孫盼盼，李宏全，尹偉

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801

【】檢測(cè)豬紅細(xì)胞類(lèi)補(bǔ)體受體I型（Complement receptor 1-like，CR1-like）與C3b活性片段能否發(fā)生結(jié)合，以期為闡明豬紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子機(jī)理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。利用前期已構(gòu)建的CR1-like、CR1-like功能域片段的重組質(zhì)粒建立酵母雙雜交檢測(cè)體系，運(yùn)用酵母共轉(zhuǎn)化的方法將誘餌質(zhì)粒（重組pGBKT7-CR1-like）與捕獲質(zhì)粒（重組pGADT7-C3b）共同轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母細(xì)胞中，分別利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）嚴(yán)格篩選共轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞，再根據(jù)報(bào)告因子是否表達(dá)來(lái)鑒別轉(zhuǎn)化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)情況，并結(jié)合菌落的顏色變化現(xiàn)象綜合判定CR1-like活性片段與補(bǔ)體C3b在酵母細(xì)胞中是否發(fā)生相互結(jié)合；然后運(yùn)用免疫沉淀技術(shù)分離酵母細(xì)胞中CR1-like與C3b結(jié)合復(fù)合物，并對(duì)該復(fù)合物的特異性進(jìn)行Western blot鑒定。試驗(yàn)成功將pGBKT7-CR1-like與pGADT7-C3b基因共轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母細(xì)胞。共轉(zhuǎn)化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能夠正常生長(zhǎng)，在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生長(zhǎng)且菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，由此表明，試驗(yàn)中酵母雙雜交系統(tǒng)建立成功，并通過(guò)試驗(yàn)獲得了陽(yáng)性酵母克隆。共同轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b質(zhì)粒的酵母菌落PCR反向鑒定結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)化的酵母菌中含有目的基因CR1-like和CR1-like，共轉(zhuǎn)化組的質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)C3b基因片段，與設(shè)計(jì)大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒成功共轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。免疫沉淀試驗(yàn)中應(yīng)用pGBKT7載體的標(biāo)簽抗體c-Myc沉淀酵母細(xì)胞中的融合蛋白，以c-Myc為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現(xiàn)特異性條帶；共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶；以HA單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，只有3、4泳道中共轉(zhuǎn)化的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶，表明在Y2HGold酵母細(xì)胞中存在CR1-like與C3b識(shí)別結(jié)合的復(fù)合物。使用CR1-like單克隆抗體沉淀酵母細(xì)胞中的融合蛋白，以CR1-like單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現(xiàn)特異性條帶；共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶；以C3單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，泳道3、4所示只有共轉(zhuǎn)化的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶，表明在Y2HGold酵母細(xì)胞中存在具有生物活性的CR1-like與C3b識(shí)別結(jié)合的復(fù)合物。通過(guò)多個(gè)單克隆抗體雜交結(jié)果，可看出誘餌質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物CR1-like、CR1-like片段與捕獲質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物C3b片段可在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生結(jié)合。豬紅細(xì)胞CR1-like發(fā)揮免疫粘附功能的識(shí)別配體為C3b，為豬紅細(xì)胞CR1-like功能域分子結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了重要數(shù)據(jù)依據(jù)。

CR1-like；C3b；酵母雙雜交；免疫粘附

0 引言

【研究意義】中國(guó)是豬肉消費(fèi)和生產(chǎn)大國(guó)[1]，養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要支柱。近年來(lái)，豬病尤其是非洲豬瘟[2-3]、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征[4]、豬流感[5]等免疫抑制性疫病的發(fā)生嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。先天免疫系統(tǒng)是豬抵抗疫病的重要防御力量，而豬紅細(xì)胞免疫是機(jī)體先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。因此，深入研究豬紅細(xì)胞免疫功能分子機(jī)理及其與疫病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系對(duì)于豬病防控具有科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】人類(lèi)醫(yī)學(xué)對(duì)紅細(xì)胞免疫粘附的分子基礎(chǔ)和機(jī)制進(jìn)行了深入研究，研究結(jié)果證實(shí)紅細(xì)胞膜上的Ⅰ型補(bǔ)體受體（erythrocyte complement receptor 1，ECR1）是紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在CR1的介導(dǎo)下，紅細(xì)胞免疫功能與阿爾茲海默氏癥[6-7]、瘧原蟲(chóng)感染[8-10]、慢性自身免疫性疾病[11-14]、老年性黃斑變性[15]等免疫抑制性疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。例如，CRANE等[16]研究發(fā)現(xiàn)Aβ在血液中形成Aβ-ICs，可以提高Aβ與補(bǔ)體系統(tǒng)中活性片段的相互作用，主要是與C1q相互結(jié)合，紅細(xì)胞的粘附以及巨噬細(xì)胞的吞噬同樣也會(huì)增加，進(jìn)而提高機(jī)體對(duì)Aβ-IC的清除能力，與這些體外的結(jié)果相一致的是，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)靜脈注射Aβ抗體形成Aβ-ICs后，血液中Aβ的清除也明顯增強(qiáng)。BRUBAKER等[17]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，獼猴的紅細(xì)胞可以免疫粘附體內(nèi)的β淀粉樣蛋白，促進(jìn)血液中β淀粉樣蛋白的清除，這種靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物紅細(xì)胞捕獲IC的清除機(jī)制在IC沉積介導(dǎo)的疾病中是至關(guān)重要的。起初人們認(rèn)為這種紅細(xì)胞免疫粘附受體是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物所特有的，隨著研究人員不斷的探索，發(fā)現(xiàn)在禽類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、嚙齒類(lèi)以及哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞也具有免疫粘附功能，且與動(dòng)物疫病的發(fā)生具有相關(guān)性。雞感染馬立克病病毒后，與雞紅細(xì)胞相關(guān)的多種免疫基因均發(fā)生了顯著的免疫應(yīng)答，推測(cè)雞紅細(xì)胞發(fā)揮一定的免疫調(diào)控作用[18]。鄭世民等[19]研究發(fā)現(xiàn)雛鴨在感染了禽流感病毒后，鴨的紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（red blood cell C3b receptor rate，RBC-C3bRR）對(duì)比未感染組顯著降低，而紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率（red blood cell immune complex rate，RBC-ICR）則明顯升高，導(dǎo)致雛鴨外周血免疫功能下降。NOMBELA等[20]對(duì)感染了病毒性敗血癥出血病毒的虹鱒魚(yú)紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)虹鱒魚(yú)紅細(xì)胞產(chǎn)生了有效的抗病毒免疫反應(yīng)。衛(wèi)含偉等[21]用改良的保存液處理紅細(xì)胞后可通過(guò)激活HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口愈合。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豬紅細(xì)胞免疫粘附受體也是一類(lèi)糖蛋白，分子量95—110 kD具有分子量多態(tài)性[22-23]，稱(chēng)作紅細(xì)胞類(lèi)補(bǔ)體受體I型（Erythrocyte complement receptor 1-like，ECR1-like）。ecr1-like通過(guò)與豬紅細(xì)胞膜蛋白4.1的相互結(jié)合而分布于豬紅細(xì)胞膜表面[24]。在ECR1-like的介導(dǎo)下，豬紅細(xì)胞能夠免疫粘附致敏免疫復(fù)合物，推測(cè)ECR1-like免疫粘附功能的發(fā)揮與血清C3b有關(guān)。體外研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)豬肺泡巨噬細(xì)胞能夠與粘附有致敏復(fù)合物的豬紅細(xì)胞相互作用并將致敏復(fù)合物捕獲[25]。【本研究切入點(diǎn)】動(dòng)物紅細(xì)胞作為機(jī)體先天免疫防御的重要組成在抵抗動(dòng)物疫病中發(fā)揮著重要作用。但是，動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的分子機(jī)理尚有一些科學(xué)問(wèn)題未能解決，尤其是介導(dǎo)動(dòng)物紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)尚不明了。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】筆者所在的課題組綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、基因工程等技術(shù)手段成功篩出ECR1-like的第3—6功能域片段、第8—11功能域片段及豬血清C3b活性片段目標(biāo)序列，并構(gòu)建了捕獲載體及誘餌載體[26]。在此基礎(chǔ)上本試驗(yàn)繼續(xù)圍繞“豬ECR1-like是否與豬血清C3b片段發(fā)生相互結(jié)合”這一科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研究，擬運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)和免疫沉淀技術(shù)對(duì)缺省培養(yǎng)基篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，定性分析ECR1-like與C3b在酵母細(xì)胞內(nèi)的識(shí)別結(jié)合關(guān)系。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2019—2020年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 質(zhì)粒與宿主菌

用于酵母細(xì)胞共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：酵母細(xì)胞株Y2HGold、Y187（TaKaRa，中國(guó)），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（天根，中國(guó)）。

用于酵母雜交試驗(yàn)：酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7-CR1-like(8-11)（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）[26]。

1.2 主要試劑

用于酵母細(xì)胞共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit I、E.Z.N.A.TMGel Extraction膠回收試劑盒（Omega，中國(guó)），限制性?xún)?nèi)切酶R I、I、I、H I、T4 DNA Ligase連接酶、卡那霉素、氨芐青霉素和50×TAE（Solarbio，中國(guó)），10 000×Super Gel Red核酸凝膠染料（Everbrite，美國(guó)），5 000 bp DNA Marker（中科瑞泰，中國(guó)）。

用于酵母雜交試驗(yàn)：Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System酵母雙雜交試劑盒（TaKaRa，中國(guó)）。

用于酵母總蛋白提取和Western blot試驗(yàn)：Yeast maker Yeast Transformation System 2、Yeast Protein Extraction Reagent酵母總蛋白提取試劑盒、Yeast Media Set 2 Plus試劑盒（TaKaRa，中國(guó)），BeaverBeads? Protein A/G Immunoprecipitation（海貍生物，中國(guó)）。

1.3 主要儀器

用于酵母細(xì)胞共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：潔凈工作臺(tái)（博訊，中國(guó)），恒溫金屬浴（博日，中國(guó)），PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)），核酸蛋白濃度分析測(cè)定儀（NanoDrop，美國(guó)），凝膠成像儀（Invitrogen，美國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（Sigma，美國(guó)），超低溫冰箱（中科美菱，中國(guó)）。

用于酵母總蛋白提取和Western blot試驗(yàn)：恒溫振蕩培養(yǎng)器（智城，中國(guó)），可調(diào)式移液器（Eppendorf，德國(guó)），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金城國(guó)勝，中國(guó)）。

用于酵母雜交試驗(yàn)：電子分析天平（Sartooeius，德國(guó)），立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江，中國(guó)），生化培養(yǎng)箱（躍進(jìn)，中國(guó)）。

1.4 CR1-like結(jié)合C3b活性片段的酵母雙雜交鑒定

1.4.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 使用Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2試劑盒將pGBKT7- CR1-like和pGADT7-C3b共同轉(zhuǎn)化入Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，主要步驟包括：取Yeast maker Carrier DNA置于95℃水浴變性3 min，然后迅速冰浴，重復(fù)3次。取1.5 mL EP管，加入Yeast maker Carrier DNA（10 mg·mL-1）5 μL、重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b各0.1 μg、Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞50 μL，輕輕混勻三者。然后加入500 μL PEG/LiAc溶液，輕輕混勻。30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。加入20 μL DMSO試劑均勻混合，置于42℃金屬浴中熱休克15 min，每5 min搖動(dòng)混勻。12 000 r/min離心15 s，去上清。加入1 mL YPD Plus液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)90 min，12 000 r/min離心15 s，去上清。用1 mL 0.9% NaCl溶液重懸酵母細(xì)胞。提前配制100 mL包含Kana（50 mg·mL-1）的SD/-Trp選擇性培養(yǎng)基，各取200 μL菌液涂布于5個(gè)SD/-Trp選擇性平板，30℃正置30 min，再倒置培養(yǎng)4 d，至白色且大小均勻的克隆菌落出現(xiàn)。挑取單菌落于5 mL YPDA中，30℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。分別收集100 μL菌液以濃度為0.9%的NaCl進(jìn)行1﹕10 000稀釋?zhuān)坎加赟D/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp（DDO）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）和SD/-Leu/-Trp/X-α- Gal/Aba（DDO/X/A）平板上30℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況和顏色變化。

重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，對(duì)共轉(zhuǎn)化組進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞：在平板上挑取單菌落于含有10 μL超純水的EP管中，95℃變性5 min，5 000 r/min離心1 min。取上清作為PCR模板，按照前期的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行[26]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，驗(yàn)證CR1-like基因是否轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。再根據(jù)TIANprep Yeast Plasmid DNA Kit酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取共轉(zhuǎn)化組的酵母質(zhì)粒，按照前期的雙酶切反應(yīng)體系[26]，驗(yàn)證共轉(zhuǎn)酵母中是否轉(zhuǎn)入C3b基因。

1.4.2 酵母雜交 按照前期的方法將對(duì)照質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)化入對(duì)應(yīng)的菌株[26]（表1）。

表1 酵母雜交

將轉(zhuǎn)化后的Y2HGold酵母細(xì)胞液涂布于SD/-Trp（50 μg·mL-1Kana）固體培養(yǎng)基，Y187酵母細(xì)胞液涂布于SD/-Leu（100 mg·mL-1Amp）固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d。

分別挑取包含pGBKT7-53的Y2HGold酵母細(xì)胞和包含pGADT7-T的Y187酵母細(xì)胞于同一管裝有500 μL 2×YPDA培養(yǎng)基的1.5 mL EP管中，渦旋混勻酵母細(xì)胞，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取100 μL菌液用0.9%的NaCl進(jìn)行1﹕10 000稀釋后，各取100 μL菌液涂布于SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/ X/A、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（QDO/X/A）平板上30℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況及菌落的生長(zhǎng)顏色。

陰性組處理同上。

1.5 酵母總蛋白的抽提及Western blot鑒定

1.5.1 酵母總蛋白的提取 按照Yeast Protein Extraction Reagent試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取酵母總蛋白。主要步驟包括：從轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7-CR1-like(8-11)的酵母培養(yǎng)平板上分別挑取一個(gè)直徑為2 mm大小的菌落于5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，共轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)+pGADT7-C3b、pGBKT7-CR1- like(8-11)+pGADT7-C3b的酵母細(xì)胞于DDO培養(yǎng)基，30℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

吸取酵母細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL至1.5 mL的EP管中，8 000 r/min，4℃離心2 min，去上清；各加入1 mL 4℃預(yù)冷的超純水重懸菌體，8 000 r/min，4℃離心2 min，去上清；加入25 μL的Yeast Protein Extraction Reagent試劑，反復(fù)吹打，重懸沉淀；在30℃水浴中溫育30 min，每10 min振蕩一次；12 000 r/min，4℃離心5 min，去上清；向沉淀中加入25 μL的PBS和25 μL的2×Protein SDS PAGE Loading Buffer溶液，使沉淀重懸。

1.5.2 免疫沉淀復(fù)合物 取4個(gè)1.5 mL的EP管，標(biāo)記為1、2、3、4，各加入30 μL磁珠懸液，每管中再加入200 μL結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗滌，將EP管置于磁性分離器上靜置1 min進(jìn)行磁性分離，棄去上清。將EP管從磁性分離器上取下后，加入200 μL的結(jié)合緩沖液重新洗滌一次。向EP管中加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸磁珠，分別吸取5 μL c-Myc單克隆抗體加入EP管中，置于水平搖床室溫20℃混合1 h后，置于磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，棄去上清。加入200 μL結(jié)合緩沖液再次洗滌。向1—4號(hào)EP管中依次加入200 μL的pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7-CR1-like(8-11)、pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b、pGBKT7-CR1- like(8-11)+pGADT7-C3b蛋白溶液200 μL，吹打混勻，置于水平搖床室溫混合1 h后進(jìn)行磁性分離，棄去上清，加入200 μL洗滌緩沖液再次洗滌。最后將磁珠懸液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，避免管壁上的抗原殘留。將新的EP管置于磁性分離器進(jìn)行磁性分離，棄去上清，每管各加入50 μL的1×SDS-PAGE Loading Buffer，置于95℃金屬浴加熱5 min，磁性分離收集上清液。

另取4個(gè)1.5 mL的EP管，將其標(biāo)記為a、b、c、d，磁珠預(yù)處理后按照上述操作。每管中分別加入100 μL的CR1-like單克隆抗體進(jìn)行磁珠的抗體吸附處理，處理完成依次加入pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7- CR1-like(8-11)、pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b、pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b蛋白溶液200 μL進(jìn)行磁珠的抗原吸附處理，最后洗脫抗原，操作方法同上。

1.5.3 酵母總蛋白的Western blot檢測(cè) 按照表2、表3配制5%的濃縮膠、10%的分離膠。將膠板固定在電泳槽中，加入4℃預(yù)冷的電泳緩沖液，加樣孔中依次緩緩加入蛋白Marker 5 μL、1.5.1中提取的各蛋白樣品10 μL進(jìn)行電泳，電壓設(shè)置為80V，至樣品剛跑過(guò)濃縮膠約1 h后，再調(diào)整為120V繼續(xù)電泳45 min，停止電泳。

切割出所需凝膠，裁剪好與凝膠大小一致的濾紙和PVDF膜。先將PVDF膜浸泡于甲醇中進(jìn)行激活，10 s后取出放入轉(zhuǎn)膜緩沖液。將電轉(zhuǎn)的夾子黑色為底浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，分別鋪上3層濾紙，凝膠，PVDF膜和另外的3層濾紙，四周對(duì)齊。將夾子夾緊并放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，對(duì)正電極，設(shè)置電壓為60V轉(zhuǎn)膜2 h。將PVDF膜取出放入脫脂奶粉封閉液中，置于水平搖床80 r/min室溫封閉2 h。載有蛋白1—4號(hào)樣品的兩張PVDF膜分別使用c-Myc單克隆抗體（1﹕1 000稀釋?zhuān)┖虷A單克隆抗體（1﹕800稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜孵育。載有蛋白a、b、c、d的兩張PVDF膜分別使用CR1-like單克隆抗體（1﹕300稀釋?zhuān)┖虲3單克隆抗體（1﹕800稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜孵育。棄去一抗孵育液，用TBST洗3次每次10 min；孵育二抗，一抗為c-Myc抗體和C3抗體的膜使用二抗為羊抗兔IgG，一抗為HA抗體和CR1-like抗體的膜使用二抗為兔抗鼠IgG，TBST按1﹕10 000稀釋?zhuān)?7℃，80 r/min孵育1 h。用TBST洗3次每次10 min。按照高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制發(fā)光液，在PVDF膜上敷上發(fā)光液，緩慢晃動(dòng)使發(fā)光液涂抹均勻，使用濾紙吸去多余發(fā)光液，用保鮮膜覆蓋，在暗室使用膠片曝光，曝光后膠片自然晾干，掃描膠片，保存圖像進(jìn)行分析。

表2 配制5%濃縮膠

表3 配制10%分離膠

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化激活酵母細(xì)胞報(bào)告因子的鑒定

將pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGADT7-C3b共同轉(zhuǎn)入Y2HGold后，在SD/-Leu（圖1-A）、SD/-Trp（圖1-B）、DDO（圖1-C）平板均長(zhǎng)出白色菌落，在DDO/X（圖1-D）和DDO/X/A（圖1-E）平板上菌落正常生長(zhǎng)且變?yōu)樗{(lán)色。將pGBKT7-CR1-like(8-11)和pGADT7- C3b共轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)同樣的結(jié)果，在SD/-Leu（圖2-A）、SD/-Trp（圖2-B）、DDO平板長(zhǎng)出白色菌落（圖2-C），在DDO/X（圖2-D）和DDO/X/A（圖2-E）平板上菌落正常生長(zhǎng)且變?yōu)樗{(lán)色。說(shuō)明豬CR1-like與C3b的識(shí)別結(jié)合激活了報(bào)告因子MEL1和AUR1-C。

A—E：共轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGADT7-C3b的酵母細(xì)胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X、DDO/X/A培養(yǎng)板的生長(zhǎng)情況

A—E：共轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(8-11)和pGADT7-C3b的酵母細(xì)胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X、DDO/X/A培養(yǎng)板的生長(zhǎng)情況

2.2 酵母雙雜交陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照培養(yǎng)

Y2HGold（pGBKT7-53）與Y187（pGADT7-T）進(jìn)行雜交后，包含兩種質(zhì)粒的酵母細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照均可以在SD/-Trp、SD/-Leu、DDO、DDO/X/A、QDO/X/A上生長(zhǎng)。且在DDO/X/A（圖3-D）、QDO/X/A（圖3-E）上菌落為藍(lán)色。Y2HGold（pGBKT7-Lam）與Y187（pGADT7-T）的酵母細(xì)胞二者雜交不能激活報(bào)告基因，酵母細(xì)胞只能在SD/-Trp（圖4-A）、SD/-Leu（圖4-B）、DDO上（圖4-C）正常生長(zhǎng)，在DDO/X/A（圖4-D）、QDO/X/A上（圖4-E）不能生長(zhǎng)，證明本試驗(yàn)中酵母雙雜交系統(tǒng)良好。

2.3 重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的基因鑒定

共同轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b質(zhì)粒的酵母菌落PCR反向鑒定結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)化的酵母菌（圖5-A）中含有目的基因CR1-like和CR1-like，共轉(zhuǎn)化組的質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)C3b基因片段（圖5-B），與設(shè)計(jì)大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒成功共轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。

2.4 CR1-like識(shí)別結(jié)合C3b的檢測(cè)

使用pGBKT7載體的標(biāo)簽抗體c-Myc沉淀酵母細(xì)胞中的融合蛋白，以c-Myc為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7- CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖6-A）。共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖6-B）。以HA單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，只有3、4泳道中共轉(zhuǎn)化的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖6-C）。表明在Y2HGold酵母細(xì)胞中存在CR1-like與C3b識(shí)別結(jié)合的復(fù)合物。

A—E：共轉(zhuǎn)化了pGBKT7-53和pGADT7-T的酵母細(xì)胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X/A、QDO/X/A培養(yǎng)板的生長(zhǎng)情況

A—E：共轉(zhuǎn)化了pGBKT7-Lam和pGADT7-T的酵母細(xì)胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X/A、QDO/X/A培養(yǎng)板的生長(zhǎng)情況

A：pGBKT7-CR1-like質(zhì)粒的電泳圖：M1：DL2 000 DNA Maker；1：共轉(zhuǎn)pGBKT7-CR1-like(3-6)；2：共轉(zhuǎn)pGBKT7-CR1-like(8-11)。B：pGADT7-C3b質(zhì)粒的電泳圖：M2：DL5 000 DNA Marker；1、2：共轉(zhuǎn)pGADT7-C3b

CR1-like單克隆抗體沉淀酵母細(xì)胞中的融合蛋白，以CR1-like單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)轉(zhuǎn)化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7- CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖7-A）。共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7- C3b和共轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖7-B）。以C3單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，如泳道3、4所示只有共轉(zhuǎn)化的酵母融合蛋白在83 kD處出現(xiàn)特異性條帶（圖7-B）。表明在Y2HGold酵母細(xì)胞中存在具有生物活性的CR1-like與C3b識(shí)別結(jié)合的復(fù)合物。

M：蛋白Marker；A、B：c-Myc抗體的Western blot檢測(cè)；C：HA抗體的Western blot檢測(cè)

M：蛋白Marker；A、B：CR1-like抗體的Western blot檢測(cè)；C：C3抗體的Western blot檢測(cè)

3 討論

免疫粘附血清致敏的免疫復(fù)合物（immune complex，IC）是紅細(xì)胞最主要的免疫功能，經(jīng)血清致敏的IC可被紅細(xì)胞I型補(bǔ)體受體（erythrocyte complement receptor 1，ECR1）通過(guò)與沉積在復(fù)合物上的C3b等補(bǔ)體片段結(jié)合，捕獲復(fù)合物，將其運(yùn)送到肝脾后被吞噬細(xì)胞吞噬，促進(jìn)體內(nèi)循環(huán)IC的清除。這種紅細(xì)胞免疫粘附清除機(jī)制對(duì)阿爾茲海默氏病[27]、支原體肺炎[28]、附紅細(xì)胞體病[29]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]和C3腎小球病[30]等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程都具有影響。豬紅細(xì)胞具有免疫功能，是機(jī)體先天免疫的重要組成部分。豬紅細(xì)胞膜上存在類(lèi)I型補(bǔ)體受體（complement receptor 1-like，CR1-like），是豬紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能的重要分子基礎(chǔ)[31]。2014年，CHENG等[32]克隆出長(zhǎng)白豬紅細(xì)胞CR1-like基因全長(zhǎng)cDNA序列，大小為4 391 bp，包含3 996 bp的開(kāi)放閱讀框，37 bp的5’-非編碼區(qū)和358 bp的3’-非編碼區(qū)，并通過(guò)生物信息學(xué)分析得出該基因位于豬的九號(hào)染色體上（GenBank，登錄號(hào)：KF 286 608），揭示了豬CR1-like蛋白是一個(gè)包含19個(gè)SCRs結(jié)構(gòu)域的補(bǔ)體受體調(diào)控類(lèi)膜糖蛋白，進(jìn)一步研究顯示，豬紅細(xì)胞上CR1-like基因具有基因多態(tài)性[33]。2015年薛翼鵬[34]成功制備了小鼠抗豬CR1-like單克隆抗體，為后續(xù)研究豬紅細(xì)胞補(bǔ)體受體提供了試驗(yàn)抗體。現(xiàn)已證實(shí)在體外共孵育條件下，豬紅細(xì)胞與豬肺泡巨噬細(xì)胞具有相互作用，豬肺泡巨噬細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合豬紅細(xì)胞表面所粘附的熒光大腸桿菌后，其形態(tài)未見(jiàn)病理變化但表面CR1-like數(shù)量顯著降低[35]。綜上所述，豬紅細(xì)胞表面存在CR1-like，但是CR1-like介導(dǎo)豬紅細(xì)胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子機(jī)理尚不清楚，僅推測(cè)豬紅細(xì)胞CR1-like發(fā)揮免疫功能與血清C3b有關(guān)。

本試驗(yàn)為了驗(yàn)證CR1-like與補(bǔ)體C3b之間的識(shí)別結(jié)合，將pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y2HGold中，檢測(cè)酵母報(bào)告因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞落在DDO/X和DDO/X/A平板能夠正常生長(zhǎng)且變?yōu)樗{(lán)色，說(shuō)明pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b表達(dá)的蛋白在酵母細(xì)胞中發(fā)生了識(shí)別結(jié)合從而激活了酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4，促使報(bào)告因子MEL1和AUR1-C發(fā)生轉(zhuǎn)錄，酵母細(xì)胞表達(dá)α-半乳糖苷酶和AUR1-C，使酵母在含有Aba和X-a-Gal的DDO/X/A培養(yǎng)板中能夠抗Aba正常生長(zhǎng)且表現(xiàn)為藍(lán)色。初步證明豬pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7- CR1-like(8-11)融合蛋白可以識(shí)別結(jié)合pGADT7-C3b融合蛋白。

本試驗(yàn)使用pGBKT7載體的標(biāo)簽抗體c-Myc免疫沉淀共轉(zhuǎn)化酵母蛋白中的復(fù)合物，再使用c-Myc抗體進(jìn)行Western blot，以確定CR1-like識(shí)別結(jié)合C3b復(fù)合物是否存在。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)化的pGBKT7-CR1- like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白以及共同轉(zhuǎn)化的pGBKT7-CR1-like(3-6)+pGADT7-C3b和pGBKT7- CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b融合蛋白內(nèi)均能檢測(cè)到特異條帶，并且條帶大小與pGBKT7-CR1-like相近（pGBKT7-CR1-like(3-6)理論大小為40 kD，pGBKT7- CR1-like(8-11)理論大小為48 kD），說(shuō)明c-Myc成功沉淀出復(fù)合物。當(dāng)使用pGADT7載體的標(biāo)簽抗體HA為一抗進(jìn)行Western blot發(fā)現(xiàn)，只在共轉(zhuǎn)酵母的蛋白中出現(xiàn)特異條帶并且與pGADT7-C3b融合蛋白的理論大小78 kD相近。對(duì)比單獨(dú)轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like的陰性對(duì)照可知，在pGBKT7載體的標(biāo)簽抗體c-Myc免疫沉淀的復(fù)合物中，存在pGADT7-C3b蛋白。說(shuō)明在共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中存在CR1-like識(shí)別結(jié)合C3b的復(fù)合物。同理使用CR1-like單克隆抗體免疫沉淀復(fù)合物后，CR1-like抗體作Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)和共轉(zhuǎn)酵母中均有CR1-like的特異條帶，條帶大小與c-Myc抗體檢測(cè)到的一致，說(shuō)明CR1-like抗體成功沉淀出復(fù)合物，pGBKT7-CR1-like融合蛋白在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)。當(dāng)使用C3抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)后，與HA抗體檢測(cè)到的結(jié)果一致，再次證明共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中存在具有生物活性的CR1-like識(shí)別結(jié)合C3b復(fù)合物。值得注意的是，在共轉(zhuǎn)化酵母蛋白的Western blot檢測(cè)中，融合蛋白的條帶分子量與pGADT7-C3b的理論值相近，并非是pGBKT7- CR1-like蛋白與pGADT7-C3b蛋白分子量的數(shù)值相加，有可能是pGBKT7-CR1-like與pGADT7-C3b之間的結(jié)合力相對(duì)較弱或結(jié)合具有可逆性，導(dǎo)致二者的識(shí)別結(jié)合復(fù)合物發(fā)生了分離。酵母細(xì)胞作為真菌，無(wú)法完美復(fù)制動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)境，融合的GAL4結(jié)構(gòu)域也有可能阻斷蛋白間相互作用的部位，僅靠酵母雙雜交單一技術(shù)手段來(lái)鑒別蛋白質(zhì)之間的相互作用具有一定局限性，后期可以運(yùn)用其他體內(nèi)體外的相互作用技術(shù)方法如GST pull-down試驗(yàn)、生物分子熒光互補(bǔ)技術(shù)等深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)體外條件下豬紅細(xì)胞CR1-like活性片段能夠與C3b活性片段發(fā)生結(jié)合，CR1-like結(jié)合C3b的區(qū)域位于第3—6功能域片段及第8—11功能域片段。

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Detection of Interaction Between Porcine Type I Complement Receptor and C3b Active Fragment

SUN YuChen, JIA RuiPu, FAN KuoHai, SUN Na, SUN YaoGui, SUN PanPan, LI HongQuan, YIN Wei

College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【】In order to provide scientific data for elucidating the molecular mechanism of porcine erythrocyte immune adhesion function, it was investigated whether CR1-like (Complement receptor 1-like, CR1-like) of porcine erythrocyte could bind to the C3b or not.【】In this study, the recombinant plasmids ofCR1-likeandCR1-likefunctional domain fragments were constructed first, which were used to establish a yeast two-hybrid detection system. The bait plasmid (recombinant pGBKT7-CR1-like) and capture plasmid (recombinant pGADT7-C3b) were co-transformed into Y2HGold yeast cells. The single deficient SD/-Leu, SD/-Trp and double-deficient SD/-Leu/-Trp (DDO) media were used to strictly screen the co-transformed yeast cells. Then, according to the expression of report factor, the growth of transformants were identified on the double-deficient medium SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal (DDO/X) or SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba (DDO/X/A) combined with the color change phenomenon of the colony to comprehensively determine whether CR1-like active fragments and complement C3b bind to each other in yeast cells or not. The CR1-like-C3b binding complex in yeast cells was then separated by immunoprecipitation, and the specificity of the complex was identified by Western blot. 【】The co-transformed yeast clones showed normal growth on SD/-Leu, SD/-Trp, DDO and DDO/X, DDO/X/A media with blue color colonies, and this indicated that positive yeast colonies were successfully obtained.The results of PCR reverse identification showed that the co-transformed yeast contained the target genesand. The C3b gene fragment appeared after the plasmid was digested, indicating that the recombinant plasmid pGBKT7-CR1-like and pGADT7-C3b were successfully co-transformed into yeast cells. In the immunoprecipitation test, the tag antibody c-Myc of the pGBKT7 vector was used to precipitate the fusion protein in yeast cells.Western blot detection with c-Myc as the primary antibody revealed that the fusion protein transformed pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)separately showed a specific band at 50kDa; the yeast fusion protein co-transformed with pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b and pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b showed a specific band at 83kDa;when the HA monoclonal antibody was used as the primary antibody for Western blot detection, no specific bands appeared in the pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)fusion proteins, and only the yeast fusion protein co-transformed in lane 3 and 4 showed a specific band at 83kD. It showed that there was a complex of CR1-like and C3b in Y2HGold yeast cells. Using CR1-like monoclonal antibody to precipitate the fusion protein in yeast cells, Western blot detection with CR1-like as the primary antibody revealed that the fusion protein transformed with pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)separately showed a specific band at 50kD;the yeast fusion protein co-transformed with pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b and pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b showed a specific band at 83kD;when the C3 monoclonal antibody was used as the primary antibody for Western blot detection, no specific bands appeared in the pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)fusion proteins,lanes 3 and 4 showed that only the co-transformed yeast fusion protein had a specific band at 83kD. This indicated that there was a biologically active CR1-like and C3b binding complex in Y2HGold yeast cells.The bait plasmid expression productsCR1-like,CR1-likefragments and capture plasmid expression products C3b fragment could be combined in yeast cells.【】In summary, the recognition ligand for porcine erythrocyte CR1-like to exert immune adhesion function was C3b, which provided an important data basis for the further analysis of the molecular structure of CR1-like functional domain.

CR1-like; C3b; yeast two-hybrid; immune adherence

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.018

2021-03-09；

2021-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31640082）、國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31702221）、山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項(xiàng)目（2019SY216）

孫雨晨，Tel：15935454178；E-mail：15935454178@163.com。通信作者李宏全，Tel：0354-6288409；E-mail：livets@163.com。通信作者尹偉，Tel：15835058784；E-mail：dkyyinwei@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）