豬卵泡閉鎖過程中circINHBB的鑒定及其對顆粒細胞凋亡的影響

馬夢楠，王慧明，王苗苗，姚望，張金璧，潘增祥

南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，南京 210095

0 引言

【研究意義】卵泡的發(fā)育和閉鎖關乎哺乳動物的繁殖力，進而影響家畜生產(chǎn)性能。而在哺乳動物中，只有極少數(shù)卵泡（少于1%）會被選擇并最終排卵為成熟卵泡，而其他卵泡則會發(fā)生閉鎖[1]。卵泡閉鎖的主要特征是卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞的凋亡，但卵泡閉鎖主要誘因是顆粒細胞的凋亡[2]。在豬卵巢中，細胞凋亡首先發(fā)生在壁層顆粒細胞的顆粒層中，而后是卵母細胞和卵丘細胞。在卵泡閉鎖過程中，顆粒細胞凋亡增多導致內(nèi)部容量減少，隨著細胞脫落和卵泡腔塌陷，最終使整個卵泡發(fā)生退化。近年來，非編碼 RNA（ncRNA），尤其是miRNA在卵巢功能中的普遍性和重要功能被逐漸揭開[3-5]。環(huán)狀RNA(circRNA) 作為一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性 ncRNA，可通過幾種不同類型的 RNA剪接方式以共價鍵形成環(huán)狀結構，且不具有 5'末端帽子和 3'末端，不易被核酸外切酶識別并剪切，因此具備高度的保守性和穩(wěn)定性。circRNA廣泛分布于真核細胞中，參與多種生理過程[6-7]，但其在家畜卵泡中的驗證和研究較少。豐富卵泡閉鎖過程中circRNA的調控機制的認知，是對家畜繁殖生理的分子調節(jié)機理進行補充，會為在實踐中提高家畜繁殖力開拓思路和提供有益參考。【前人研究進展】顆粒細胞的凋亡是受到多種細胞因子調控的及其精確和復雜的生理過程，非編碼RNA如miRNA已被廣泛研究參與顆粒細胞的凋亡[8-9]。有研究表明circRNA作為調節(jié)因子參與了卵巢卵泡的發(fā)育過程。例如：在女性卵巢衰老過程中存在差異表達的circRNA，其中circRNA-103827和circRNA-104816參與調控卵巢類固醇的生成，從而影響卵泡的發(fā)育[10]。在成年和幼年的小鼠卵巢中鑒定了許多差異表達的 circRNA，其中的circEGFR的表達量在成年小鼠卵巢中顯著上調，circEGFR是一種與雌激素信號相關的 circRNA，并且circEGFR調控卵泡發(fā)育和顆粒細胞的增殖[11]；波爾山羊和麻城黑山羊的卵泡中有37個差異表達的circRNA，并且麻城黑山羊的繁殖率比波爾山羊更高，表明circRNA的差異表達可能對卵巢卵泡的發(fā)育產(chǎn)生影響從而導致繁殖率的不同[12]；在牛中，circRNA與BMP15和GDF9相互作用，調節(jié)牛卵丘細胞的狀態(tài)，從而影響卵泡的生長[13]；筆者前期實驗通過全基因組circRNA測序證實，豬卵泡中有大量circRNA的表達，且卵泡閉鎖過程中的circRNA的表達水平發(fā)生了顯著變化，表明 circRNA在豬卵泡閉鎖過程中具有調控潛力。【本研究切入點】抑制素（Inhibin,INH）是一種性腺糖蛋白激素，由兩個α亞基或一個α亞基和一個β亞基組成二聚體，主要由雌性動物卵巢卵泡的顆粒細胞產(chǎn)生。INH可以反饋抑制垂體前葉促卵泡激素FSH的釋放，調節(jié)卵泡的生成，是控制哺乳動物排卵的重要因子[14]。前期的 circRNA測序發(fā)現(xiàn)，INHβ亞基的編碼基因INHBB可能通過其前體 mRNA的反向剪切編碼一個 circRNA，即circINHBB。但circINHBB的序列結構及其在卵泡閉鎖和顆粒細胞中的作用尚待驗證和探索。【擬解決的關鍵問題】本文旨在驗證circINHBB的結構和細胞生物學分布，明確其在卵泡閉鎖過程中的表達變化，并探索其對顆粒細胞凋亡的調控作用。

1 材料與方法

研究于2018年9月至2019年12月在南京農(nóng)業(yè)大學動物科學類實驗教學中心（國家實驗教學示范中心）完成。

1.1 樣品采集

豬卵巢選自淮安蘇食肉品屠宰點180日齡的三元雜交后備母豬，屠宰后10 min內(nèi)采集表面光滑，卵泡分布均勻，顏色呈淡粉色，無紅體與白體的卵巢，置于37℃含雙抗（青霉素、鏈霉素各100 U·mL-1）的生理鹽水中，3 h內(nèi)帶回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.2 卵泡的分類

用含有青霉素與鏈霉素的 37℃ 無菌生理鹽水清洗卵巢，在培養(yǎng)皿中用手術刀，眼科鑷剝離直徑約5mm的單個卵泡。依據(jù)外觀的形態(tài)特征，P4/E2比率和顆粒細胞的密度分為健康卵泡與早期閉鎖卵泡，依據(jù)參考文獻[15]改進的具體標準見表1。

表1 健康和早期閉鎖豬卵泡的判定指標Table 1 Judgment criteria for porcine healthy and early atresia follicles

1.3 顆粒細胞培養(yǎng)

首先用含有青霉素與鏈霉素的37°C無菌生理鹽水和 37°C的 75%乙醇交替清洗卵巢，然后用 10mL注射器抽取直徑為 3—6mm卵泡的卵泡液及顆粒細胞，1 000×g離心5min去除卵泡液；用含有1%雙抗的 PBS清洗顆粒細胞兩次，1 000×g離心 5min去除PBS后，用完全培養(yǎng)基（含體積分數(shù)10%胎牛血清和 1%雙抗的 DMEM/F12培養(yǎng)基）重懸細胞，充分吹打至散開并接種于12孔（用于RNA提取和流式細胞實驗）或 6孔（用于蛋白提取）板中；放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5% CO2培養(yǎng)。36 h后觀察顆粒細胞貼壁情況，棄去培養(yǎng)基及未貼壁的顆粒細胞、卵母細胞，用PBS清洗貼壁的顆粒細胞，繼續(xù)后續(xù)試驗。

1.4 RNA提取及反轉錄

豬顆粒細胞轉染24h后，用PBS沖洗細胞兩次，按照Trizol試劑（Invitrogen公司）說明書提取顆粒細胞RNA（每個孔用量1mL），用紫外比色法測定總RNA的濃度和純度，用1.4%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量。吸光值為1.8—1.97，且18S、28S條帶清晰的RNA樣品可用于反轉錄。取1 μg質量合格的總RNA用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa）試劑盒進行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說明書操作。反轉錄產(chǎn)物cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞轉染

circINHBB-siRNA，即si-circINHBB（sens -e：5'-GGCUCAGGCCCCGGCGGAGTT-3'；antisense：5'-CUCCGCCGGGGCCUGAGCCTT-3'）及陰性對照 nc-siRNA由吉瑪（上海）生物公司合成。正常培養(yǎng)豬顆粒細胞 48h后，用 Lipofectamine 3000（Invitrogen）和 Opti-MEM（Gbico）轉染豬顆粒細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 引物設計與qRT-PCR反應

定量引物設計：根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的INHBB基因mRNA序列和qPCR反應要求，用Primer Premier5.0軟件設計反向引物，GAPDH作為內(nèi)源對照。全部引物由深圳華大生物技術有限公司合成，使用時用ddH2O稀釋至工作濃度。引物序列信息和擴增條件見表2。

表2 PCR引物及反應條件Table 2 Primer and PCR reaction conditions

PCR的具體操作方法按照 2×Vazyme LAmp Master Mix試劑盒（南京諾唯贊）說明進行。PCR產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳和Sanger測序（上海生工生物工程股份有限公司）進行序列驗證。

qRT-PCR的詳細步驟參見 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（南京諾唯贊）說明。GAPDH作為內(nèi)參。根據(jù) LIVAK等[16]的方法進行數(shù)據(jù)分析，即處理組的ΔCT=處理組目標基因的CT -處理組內(nèi)參基因的CT，對照組的ΔCT=對照組目標基因的CT-對照組內(nèi)參基因的CT；ΔΔCT=處理組的ΔCT -對照組的ΔCT。基因表達的變化倍數(shù)表示為 2-ΔΔCT，各基因表達量用均值表示。每個實驗組包含6個生物學重復，每個生物學重復進行3次技術重復。

1.7 熒光原位雜交（FISH）

在蓋玻片上培養(yǎng)豬顆粒細胞，用 4%多聚甲醛（含DEPC）固定20 min，PBS（PH7.3）振蕩3次，最后加入蛋白酶 K（20 μg·mL-1）消化 5 min。隨后用CY3標記的circINHBB特異性探針5'-CGCTCC GCCGG-GGCCTGAGCCCCCG-3'（武漢塞維爾生物公司）標記 circINHBB。并用DAPI進行細胞核染色。在Nikon立式熒光顯微鏡（日本Nikon DS-U3）上采集圖像。

1.8 細胞凋亡檢測

豬顆粒細胞轉染48 h后, 首先用PBS洗滌貼壁的豬顆粒細胞。隨后使用 Annexin V-FITC/PI staining試劑盒（南京諾唯贊）對顆粒細胞進行染色。最后運用流式細胞儀（FACSCalibur，美BD）檢測。使用FlowJo v7.6軟件分析數(shù)據(jù)。每個試驗組包含5個技術重復。

1.9 生物信息學軟件及在線分析工具

（1）生物信息學軟件

Primer premier 5.0 軟件：引物設計；

Chromas 2.0軟件：對測序結果進行峰圖分析；

DNAMAN V5.22 軟件：進行核苷酸、氨基酸序列比對分析；

GraphPad Prism 5 軟件：繪制圖表并進行數(shù)據(jù)分析。

clipSearch軟件：預測circINHBB結合的miRNA。

（2）在線分析工具

GenBank數(shù)據(jù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）：獲取基因序列；

1.10 統(tǒng)計分析

本實驗所有數(shù)據(jù)分析利用 SPSS 20.0和Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（mean±SEM）表示。P<0.05（*）和 0.01（**）分別被認為是差異顯著和極顯著。

2 結果

2.1 健康卵泡與閉鎖卵泡的數(shù)據(jù)

根據(jù)課題組前期建立的研究方法，獲得直徑 3—5 mm豬中等卵泡。結合形態(tài)學和生物化學標準，即外觀形態(tài)特征、P4/E2比率和卵泡液顆粒細胞密度指標（表 1）區(qū)分健康卵泡和早期閉鎖卵泡（圖1）。依據(jù)上述方法選擇符合各項判定指標的健康卵泡6個、早期閉鎖卵泡6個。樣本信息及具體分組見表3。

表3 卵泡樣本信息Table 3 Sample information of ovary

2.2 circRNA的鑒定

由于circRNA由mRNA前體反向剪切形成，設計引物時以預測的線性RNA剪切位點方向為引物3′端，向線性 RNA兩側方向設計引物，從而擴增包含剪切位點的circRNA序列。circINHBB的正、反向引物設計原理如圖2-A所示。circINHBB的PCR產(chǎn)物電泳結果顯示出單一條帶，表明了circINHBB在卵泡中有表達，且具有特異性（圖2-B）。

對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序的結果進一步確認了 circINHBB的堿基序列，并明確了 INHBB 線性mRNA前體（5′UTR區(qū)域）成環(huán)反應的剪切位點（圖2-C）。

2.3 circINHBB在豬顆粒細胞中的分布

為了驗證circINHBB在豬卵泡顆粒細胞中的分布情況，我們通過FISH方法，用circINHBB探針檢測了其在健康顆粒細胞中的表達情況。結果可見circINHBB（紅色熒光）主要存在于顆粒細胞質中，且表達量較高，在細胞核中表達量較低（圖 3）。由此可見circINHBB可能主要通過轉錄后機制參與對顆粒細胞的調控。

2.4 circINHBB在豬健康、早期閉鎖卵泡的差異表達

對健康和早期閉鎖卵泡的 circINHBB進行 qRTPCR檢測可見circINHBB在健康卵泡中表達量較高，而在早期閉鎖卵泡中表達量顯著下降（圖 4），可見circINHBB參與了卵泡閉鎖過程。

2.5 circINHBB抑制豬顆粒細胞的凋亡

為了探索circINHBB對豬顆粒細胞凋亡的影響，我們首先合成了circINHBB的特異性siRNA，然后將其轉染到豬顆粒細胞中。qRT-PCR結果證明si-circINHBB能顯著抑制circINHBB的表達水平，敲減效率約為50%（圖5-A）。同時INHBB的線性mRNA表達水平不受si-circINHBB的影響（圖5-B），可見該siRNA的敲減效果具有特異性。隨后，用流式細胞術（FACS）檢測si-circINHBB轉染前后的顆粒細胞凋亡水平。結果顯示，敲減circINHBB后，顆粒細胞凋亡率顯著上升，可見circINHBB對顆粒細胞凋亡有顯著的抑制作用（圖5-C）。

2.6 circINHBB互作的miRNA

circINHBB存在于豬卵泡顆粒細胞的細胞質中，提示其可能作為 miRNA的分子海綿調控豬卵泡的發(fā)育。為進一步探索circINHB可能參與調節(jié)的miRNA，我們利用生物學信息工具預測 circINHBB互作的miRNA，結果表明，circINHBB可能與10個miRNA相互作用（表4）。

表4 circINHBB互作的miRNATable 4 circINHBB interacting miRNA

3 討論

近年來，circRNA參與的分子調控成為了ncRNA調控研究的新熱點。circRNA對核酸外切酶具有抗性，因此在哺乳動物細胞中半衰期較長。circRNAs的普遍性、保守性、組織/細胞特異性和穩(wěn)定性使其成為了比miRNA更理想的生物標志物候選者[17]。研究表明在人類血液、唾液和胃液中也檢測到了circRNAs，這進一步提高了 circRNAs作為有效診斷和預后生物標志物的潛力[18]。目前，在人卵巢顆粒細胞[19]、胎盤[20]和睪丸[21]中的circRNA表達譜已有研究，并得出了circRNA與這些生殖相關組織的病理特征密切相關的結論。筆者前期在豬中等有腔卵泡中的circRNA表達譜研究[22]是家畜繁殖學領域中對circRNA的首次探索。本研究驗證了circINHBB在豬卵泡顆粒細胞中的表達，并發(fā)現(xiàn)其與卵泡閉鎖過程息息相關。卵泡中的circINHBB的鑒定可能為畜牧業(yè)分子育種和生殖醫(yī)學提供新的circRNA生物標記物。最近，越來越多的證據(jù)表明，circRNA可能通過多作為競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA），通過高效結合某個 miRNA[23]或作為 miRNAs海綿[24]特異性吸附多個 miRNAs，從轉錄后水平調節(jié)基因的表達。筆者研究發(fā)現(xiàn)circINHBB主要在顆粒細胞質中表達。表明circINHBB可能是通過作為miRNAs分子海綿發(fā)揮生物學功能。

在生殖領域，miRNA在顆粒細胞凋亡、卵泡閉鎖過程中的參與已經(jīng)在人、小鼠、豬和牛身上得到了很好的研究和廣泛證實[18]。筆者通過生物信息工具的預測分析發(fā)現(xiàn)，circINHBB可能與10個miRNA相互作用。研究表明，miR-342是Notch信號通路的下游分子，miR-342可以調控 TGF-β信號通路[25]并且 miR-342抑制PIK3R1的表達從而激活Akt信號通路[26]；miR-432通過抑制IGF的表達抑制Akt信號通路從而抑制細胞的增殖[27]；miR-122可以通過直接靶向TGFBR2抑制TGF-β/ Smad信號通路[28]。大量的研究表明TGF-β信號通路調控豬卵泡的發(fā)育和顆粒細胞的凋亡[29-31]；Notch信號通路調控卵泡的生長，卵母細胞的減數(shù)分裂，卵巢的血管生成和類固醇激素的生成[32]；在豬卵泡顆粒細胞中，抑制Notch信號通路時，將促進NPC1和StAR的表達從而刺激孕激素分泌[33]；此外，研究證實IGF通過PI3K/ Akt信號通路促進豬顆粒細胞的增殖[34]。綜上，circINHBB可能通過競爭結合miR-342、miR-432和miR-122從而調控卵泡的閉鎖（圖6）。

值得注意的是，INHBB作為circINHBB的編碼基因，同時也編碼INHB的β亞基，而INH是重要的FSH的負調節(jié)因子。據(jù)報道，抑制素活性的降低可能導致FSH水平升高，隨后每個周期招募的卵泡數(shù)量過多，最終導致卵泡池提前耗盡，造成卵巢早衰（POF）[14]。circINHBB的剪接可能通過與線性INHBB mRNA的競爭，抑制INHBB的剪接和翻譯，從而促進FSH的調節(jié)作用，促進顆粒細胞增殖以及卵泡的生長和發(fā)育（圖6）。

4 結論

筆者在豬卵泡中鑒定了一個新的，由 INHBB基因編碼的 circRNA，即 circINHBB。它在卵泡顆粒細胞質中表達，在豬卵泡閉鎖過程中顯著下調，并具有抑制顆粒細胞凋亡的功能。circINHBB的作用機制可能通過作為miRNA的分子海綿，通過TGF-β、Notch等信號通路參與調控顆粒細胞凋亡及卵泡閉鎖過程。本研究為進一步完善circRNA對卵泡閉鎖、顆粒細胞凋亡的影響及調控機理提供了參考。