新疆某地區犬流感病毒血清學及病原學調查

米曉云，盛肖剛，吳建勇，汪萍，楊學云，魏玉榮*

（1新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆 烏魯木齊，830013）

（2新疆動物疫病研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830013）

（3新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，新疆 烏魯木齊830011）

犬流感（canine Influenza，CI）是一種由犬流感病毒（Canine Influenza Virus，CIV）引起的急性接觸性呼吸道傳染病。犬是流感病毒生態循環中的重要中間宿主，馬流感病毒（H3N8亞型）、禽流感病毒（H3N2亞型、H5N1亞型、H5N2亞型和H10N8亞型）和人流感病毒（H1N1亞型）等均可感染犬[1-6]。犬H3N2亞型流感毒株2006年由中國分離并報道，其基因序列與韓國水鳥的禽源H3N2基因序列高度同源[7-8]。隨后研究報道，犬H3N2亞型流感在中國、韓國、泰國及美國等地流行[9-12]。盡管目前尚未有CIV跨種感染人的報道，但犬的流感病毒中間宿主作用和“病毒混合容器”角色，注定無法忽視它在流感病毒生態循環中的重要作用，及其對人類公共衛生安全造成潛在的威脅。為了解烏魯木齊地區流浪犬和寵物犬群體中流感現狀，評估其對公共衛生危害性，本研究對部分流浪犬和寵物犬進行了犬流感病毒血清學和病原學調查。

1 材料與方法

1.1 被檢樣本

流浪犬基地流浪犬血清樣本和鼻拭子樣本各100份采集于2019年1月；寵物店就診寵物犬血清樣本150份和鼻拭子樣本79份收集于2019年1月至2019年9月。鼻拭子樣本放置于含500 μL PBS緩沖液（pH 7.2）的2 mL離心管中。所有被檢樣本-20℃保存備用，統一檢測。

1.2 主要試劑

DL 2000 DNA Marker和TakaRa PrimeScriptTM One Stemp RT-PCR Kit Ver.2購自購自 TakaRa；ID Sreen?influenza A Antibody Comptition Multi-species試劑盒購自ID VET；TIANamp Virus RNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物

根據NY/T-772-2013合成流感檢測通用引物M229[13]，根據文獻合成擴增 CIV 檢測引物 cH3N2-602F和cH3N2-1145R[14]。參照GenBank序列（登錄號：MK212413、MK212411）設計HA和NA基因引物，見表1。引物由新疆昆泰銳生物技術有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 CIV血清學檢測

-20℃保存的鼻拭子樣本56℃滅活處理30 min后加入直徑3 mm鋼珠3粒，將離心管置于Tissuelyser-LT破碎儀中進行震蕩5次，50 Hz，30 s/次。震蕩結束后離心管至4℃離心機中8000 rmp離心5 min，取離心管中上清液提取病毒RNA，保存于－80℃備用。CIV RNA提取操作按TIANamp Virus RNA Kit說明書于生物安全柜中進行。

1.5 CIV基因擴增

以提取的病毒RNA為模板，先擴增M基因，檢測是否流感病原學陽性。具體按TakaRa Prime-ScriptTM One Stemp RT-PCR Kit Ver.2說明書操作，在0.2 ml PCR管中加反應體系共50 μL：2×Onestep RT-PCR buffer 25 μL，酶混合液4 μL，M-229 U/M-229 L（20 pmol/μL）4 μL，無RNA水14 μL，RNA模板3 μL；其中陰性對照模板為3 μL無RNA水。反應參數為：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30 cycles，72 ℃保溫10 min。PCR擴增結束后，取產物10 μL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。有特異性條帶的擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序為CIV M基因的樣本，按上述方法，用引物cH3N2-602F/cH3N2-1145R擴增，反應參數為：42 ℃ 30 min；94 ℃ 5min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72℃ 35 s，30 cycles，72℃保溫10 min。PCR擴增結束后，取產物10 μL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。有特異性條帶的樣品，分別再用引物cH3N2-HA-l/cH3N2-HA-1701R和cH3N2-NA-l/cH3N2-NA-1403R擴增流感HA基因和NA基因，反應參數為：42℃30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 cycles，72 ℃保溫10 min。PCR擴增結束后，產物10 μL經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴增產物再次送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 序列比較分析

測序序列經NCBI中BLASTn比對確認，用Lasergenev7.1 DNAStar軟件進行序列整理、校對和拼接，利用MEGA5.0軟件繪制系統進化樹。

2 結果

2.1 犬流感血清學結果

采集的100份流浪犬血清樣本和150份寵物犬血清樣本進行ELISA檢測，結果顯示，流浪犬CIV抗體陽性率58%（58/100），寵物犬CIV抗體陽性率5.33%（8/150），見表2。

表2 犬血清流感抗體ELISA方法檢測結果

2.2 CIV病原學結果

2.2.1 CIV基因擴增結果

M基因擴增與測序鑒定，以CIV鼻拭子樣本RNA為模板，One-step RT-PCR方法擴增目的基因，電泳結果顯示100份流浪犬中有4份樣本的PCR產物可見約229 bp條帶，寵物犬79份樣本中有1份PCR產物大小與預期大小相符，見圖1。有特異性條帶的PCR產物純化后送基因公司測序，經BLASTn比對，所測序列均為CIV基因。

圖1 鼻拭子樣本M基因擴增結果

H3N2亞型CIV的初步鑒定，將測序鑒定為CIV的RNA樣本，再次用引物cH3N2-602F/cH3N2-1145R擴增，均可見預期540 bp的特異性條帶，見圖2。

圖2 鼻拭子樣本H3N2亞型初步鑒定結果

HA和NA基因擴增與測序鑒定，經引物cH3N2-602F/cH3N2-1145初步鑒定為H3N2亞型的2份流浪犬RNA樣本和1份寵物犬RNA樣本再次擴增HA和NA基因，電泳結果顯示3份樣本均有1701 bp和1403 bp的預期大小特異性條帶，見圖3和圖4。

圖3 鼻拭子樣本HA基因擴增結果

圖4 鼻拭子樣本NA基因擴增結果

2.2.2 HA和NA基因測序分析

測序序列經BLASTn比對確認，用Lasergenev 7.1 DNAStar軟件進行序列整理、校對和拼接，拼接的核苷酸序列再次進行BLASTn比對，可見拼接序列與犬流感H3N2亞型同源性最高，將其分別命名為A/canine/Xinjiang/1/2019(H3N2)、A/canine/Xinjiang/2/2019(H3N2)和 A/canine/Xinjiang/3/2019(H3N2)。

2.2.3 HA基因遺傳進化分析

運用MEGA5.0軟件構建基于HA基因的H3N2 CIV遺傳進化樹，見圖5。從遺傳關系可見，2016年后的H3N2 CIV形成一個獨立的分支，本研究測序的3株CIV也處于此分支。分析病毒分子特征，這一分支的HA蛋白的第226位是Q（谷氨酰胺）、第228位是G（甘氨酸）、146位是S（絲氨酸）、第242位是I（異亮氨酸）。而2006年至2015年期間的CIV HA蛋白的第146位是G（甘氨酸）或S（絲氨酸）、第242位是V（頡氨酸）。

圖5 基于HA基因的H3N2亞型流感毒株遺傳進化分析

3 討論

2012年至2017采集自北京、南京、上海和西安的犬樣本CIV H3N2抗體陽性率為13.5%（54/399），其中2017年犬H3N2抗體陽性率為6.35%，而2012年至2013年期間H3N2亞型抗體陽性率為3.5%，抗體陽性率的明顯升高表明目前流行的毒株可能更具傳染性[15]。本研究中流浪犬CIV抗體陽性率58%（58/100），寵物犬CIV抗體陽性率5.33%（8/150）。流浪犬CIV抗體陽性率高可能與采樣時間及采樣群體有關。流浪犬血清樣本是2019年1月集中采集于流浪犬收養基地，推測犬群中正在或曾經有CIV流行。寵物犬血清采集于寵物醫院就診犬，時間相對分散，樣品相對較少，無法考察其流感抗體陽性率是否與性別、品種和年齡具相關性，病原學陽性率低可能與樣本保存時間相關。本研究中病原學檢測有5份樣品（5/179）可擴增出CIV M基因序列，經分型引物初步鑒定為H3N2亞型，有2份流浪犬樣本及1份寵物犬樣本可擴增出完整的HA和NA基因序列，測序為CIV H3N2亞型。測序確認的4只CIV抗原陽性流浪犬其血清抗體也是陽性。

HA蛋白負責流感病毒與唾液酸受體的結合、入侵和膜融合，在流感病毒跨種傳播中發揮重要作用。H3亞型流感病毒，當226位為L（亮氨酸）而228位是S（絲氨酸），HA蛋白結合人α-2,6受體，而當226位是Q（谷氨酰胺）而228位是G（甘氨酸），HA則偏好結合禽α-2,3受體[16]。LYU Y L等[15]認為2016年以后的H3N2 CIV是有別于以前的H3N2亞型并將其取代的新進化分支，推測起源于韓國或美國的H3N2 CIV。該分支的HA具有禽α-2,3受體結合位點，同時在第146和第242位有氨基酸突變。2006-2015年期間的CIV H3N2亞型HA蛋白第146是G（甘氨酸）和S（絲氨酸）的頻率分別為91.89%和8.11%；第242位是V（頡氨酸）的頻率是100%[15]。而2017年至2019年期間的CIV H3N2亞型HA蛋白第146是S（絲氨酸）和第 242位是 I（異亮氨酸）的頻率均是 100%[15]。人H3N2亞型HA蛋白第146是S（絲氨酸）和G（甘氨酸）的頻率分別是99.57%和0.42%；第242位是I（異亮氨酸）和V（頡氨酸）的頻率分別是99.29%和0.39%[17]。由此可見HA第146S和242I的突變有利于CIV在哺乳動物中流行。本研究測序的3株CIV處于2016年后的新進化分支，發生了適應哺乳動物的HA第146S和242I突變。

寵物犬和流浪犬已逐漸成為流感病毒進化和繁衍的“溫床”，在流感病毒生態循環中起到重要作用。目前雖未有強毒型CIV的報道，但是CIV亞型在持續增加。借鑒H1N1亞型豬流感pdm09病毒跨宿主感染人之前曾在豬體內數十年循環適應事件，2016年后流行于中國的進化新分支CIV H3N2的哺乳動物潛在適應性及其公共衛生安全需進一步評估。我們應積極監測以期及時阻斷CIV的群體傳播和適應，同時加強檢疫，避免出現更多新亞型CIV。

4 結論

2019年新疆某地區犬樣本CIV血清學檢測流浪犬和寵物犬抗體陽性率分別為58%和5.33%；CIV病原學檢測流浪犬和寵物犬抗原陽性率分別為4%和1.27%；病原學測序分析的3株CIV屬H3N2亞型2016年后新進化分支，HA蛋白分析可見第146S和242I突變。HA蛋白中氨基酸哺乳動物適應突變對公共衛生安全具有潛在威脅。