基于SSR分子標(biāo)記的13個(gè)白三葉(Trifolium repens L.)品種指紋圖譜構(gòu)建

馬驄毓， 韓重陽(yáng)， 馬賽男， 李旭旭， 蔡家邦， 汪 陽(yáng)， 張新全， 聶 剛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院， 四川 成都 611130)

白三葉(TrifoliumrepensL.)是一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科植物，在全世界溫帶地區(qū)廣泛分布，因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且適應(yīng)范圍廣，再生能力強(qiáng)，不僅被用作優(yōu)質(zhì)牧草[1]，還可廣泛應(yīng)用于水土保持和城市綠化，具有良好的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]，在我國(guó)西南地區(qū)被廣泛栽培利用。目前，生產(chǎn)上大量應(yīng)用的品種主要為1988年審定的‘胡依阿’白三葉及2002年審定的‘海法’白三葉[3-5]。全國(guó)審定白三葉品種僅6個(gè)，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需求，因此，生產(chǎn)上引入大量適應(yīng)性強(qiáng)、表現(xiàn)突出的國(guó)外白三葉品種用于栽培飼草、草地建植和植被恢復(fù)等。

隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為植物新品種鑒定的重要手段[6]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSR)分子標(biāo)記技術(shù)是一類(lèi)建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的一種遺傳標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[7]。基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的DNA指紋圖譜可有效的鑒定白三葉品種，為品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。雖然SSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多花黑麥草(LoliummultiflorumL.)[8]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[9]、鴨茅(DactylisglomerataL.)[10]、早熟禾(PoaannuaL.)[11]等草類(lèi)植物的品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建及鑒定中，但針對(duì)白三葉品種鑒定及DNA指紋圖譜構(gòu)建方面研究鮮有報(bào)道。目前，白三葉SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究多集中在遺傳多樣性分析方面，張鶴山等[12]利用SSR分析從國(guó)內(nèi)外收集的49份白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性，認(rèn)為白三葉種質(zhì)間差異較大，具有豐富的遺傳多樣性。李莉等[13]利用SSR標(biāo)記對(duì)貴州野生22份白三葉種質(zhì)資源進(jìn)行了系統(tǒng)分析，揭示了貴州地方品種間的親緣關(guān)系。

本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析國(guó)外不同來(lái)源的13個(gè)白三葉品種間的遺傳多樣性，同時(shí)構(gòu)建DNA指紋圖譜，為白三葉育種材料的選擇及品種的快速鑒定提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)白三葉品種的收集

本研究使用的13個(gè)白三葉(TrifoliumrepensL.)品種見(jiàn)表1，采集的13個(gè)白三葉參試品種均種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州基地(30°32′N(xiāo)，103°39′E，海拔508 m)。

表1 13份不同白三葉品種來(lái)源信息

1.2 DNA提取

隨機(jī)取樣于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地。從30株單株中隨機(jī)采集30片新鮮幼葉，每10片鮮葉混合構(gòu)建一個(gè)獨(dú)立的混樣池(Bulk)，每個(gè)品種3個(gè)混樣池(Bulk)作為3次重復(fù)[14-15]。采用安全型植物DNA小提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司，Magen?,Guangzhou,China)直接提取白三葉基因組DNA。測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量后，將DNA稀釋至20 ng·μL-1，并置于4℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)引物篩選自Griffiths等[16]報(bào)道的白三葉遺傳連鎖圖譜，通過(guò)對(duì)染色體不同片段位置上的引物進(jìn)行均勻選擇，將所選的264對(duì)SSR引物進(jìn)行初篩，基于“多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、條帶清晰穩(wěn)定”的原則，共篩選出20對(duì)引物(表2)來(lái)擴(kuò)增白三葉SSR片段。PCR擴(kuò)增的總體積為20 μL，其中含有2 μL(20 ng·μL-1)的參試品種DNA，10.5 μL的2×Taq PCR MasterMix II(天根?，北京，中國(guó))，1.4 μl(10 pmol·μL-1)正向和反向引物混合物，以及6.1 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增使用熱循環(huán)參數(shù)，程序如下:94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃鏈延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃鏈延伸5 min，4℃保存。

表2 SSR引物信息

擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。在0.1%的AgNO3溶液中銀染15 min后在NaOH溶液中顯色。將凝膠置于燈光下，用數(shù)碼照相機(jī)拍照保存以供后期分析使用[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖中的明亮條帶或清晰弱帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。以“1”和“0”兩種數(shù)字表示條帶的分布情況。“1”代表有條帶的位置，“0”代表無(wú)條帶的位置，建立原始標(biāo)準(zhǔn)0/1矩陣。計(jì)算多態(tài)性條帶比率(Percentage of polymorphic bands，PPB)和引物多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content，PIC)，PICi=2fi×(1—fi)(fi表示第i個(gè)基因的頻率)。利用GenAIEx 6.4分析計(jì)算品種內(nèi)部和品種之間的變異分布，使用NTSYS-PC 2.10e和MEGA 6軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，利用Chemilmager 4400軟件估算每個(gè)擴(kuò)增片段的分子量大小。根據(jù)所選SSR引物制作DNA指紋圖譜，對(duì)擴(kuò)增樣品中出現(xiàn)至少兩次的條帶進(jìn)行計(jì)數(shù)，即每個(gè)品種出現(xiàn)至少2次相同分子量的條帶，然后利用Excel 2010軟件對(duì)波段統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，構(gòu)建13個(gè)白三葉草品種的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉草品種遺傳分異分析

試驗(yàn)引物篩選自Griffiths等[16]報(bào)道的白三葉遺傳連鎖圖譜，通過(guò)對(duì)染色體不同片段位置上的引物進(jìn)行均勻選擇，將所選的264對(duì)SSR引物進(jìn)行初篩，基于“多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、條帶清晰穩(wěn)定”的原則，共篩選出20對(duì)引物。3組供試品種混合樣本擴(kuò)增，只分析至少出現(xiàn)兩次的清晰可辨條帶(圖1)。結(jié)果表明，13個(gè)白三葉品種在20對(duì)引物中共檢測(cè)出了115條清晰可見(jiàn)的條帶，其中11個(gè)條帶無(wú)多態(tài)性，104條帶具有多態(tài)性(占90.4%)(表3)。此外，每對(duì)引物的多態(tài)性條帶(PPB)的百分比在50%～100%之間，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度在100～250 bp之間。在20對(duì)引物中，gtrs167擴(kuò)增條帶最多，擴(kuò)增總條帶數(shù)達(dá)9條，引物gtrs171多態(tài)性信息含量最低，為0.198；引物gtrs949的PIC最高為0.455。本試驗(yàn)所使用的20對(duì)引物中平均每對(duì)引物擴(kuò)增出5.75個(gè)條帶，多態(tài)性條帶5.2條。所有引物的PIC范圍為0.198～0.455，每個(gè)SSR位點(diǎn)的PIC均值為0.333。

圖1 引物gtrs540在13個(gè)白三葉品種的擴(kuò)增

表3 SSR引物在白三葉品種上的擴(kuò)增結(jié)果

AMOVA結(jié)果顯示(表4)，通過(guò)SSR分子標(biāo)記獲得的總差異的49%存在于白三葉品種間，51%存在于白三葉品種內(nèi)。品種之間有極顯著差異(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 基于SSR原始數(shù)據(jù)的白三葉品種的分子方差分析

2.2 13份白三葉品種的聚類(lèi)分析

基于遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離矩陣，使用NTSYS-pc 2.10e和MEGA 6對(duì)13個(gè)白三葉品種進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)。結(jié)果表明，其品種內(nèi)遺傳相似性系數(shù)的平均變異范圍為0.686～0.959，品種間遺傳相似性系數(shù)的平均變異范圍0.556～0.739。13個(gè)白三葉品種間，‘超級(jí)海法’和‘海法’的遺傳相似性系數(shù)(GS)最大，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系最近。‘米莉格’和‘克朗德’的遺傳相似性系數(shù)(GS)最小，即遺傳距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。白三葉品種‘超級(jí)海法’的一枝中混合了‘海法’的一個(gè)樣品，可能由于‘超級(jí)海法’在選育過(guò)程中是基于‘海法’白三葉為親本選育，故具有較近的親緣關(guān)系。‘艾麗絲’和‘超級(jí)胡依阿’各僅有一小枝也被劃分到同一枝上，其余品種都可以較好的聚在一起。

圖2 SSR標(biāo)記對(duì)13份白三葉品種的聚類(lèi)分析

2.3 13份白三葉品種的主成分分析

為更直觀的了解13個(gè)白三葉品種之間的親緣關(guān)系，采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)(圖3)。其中第一主成分的貢獻(xiàn)率為17.4%，白三葉品種‘克朗德’分布于PC1坐標(biāo)軸的左側(cè)，‘西維特’和‘米莉格’分布于PC1坐標(biāo)軸的右側(cè)。第二主成分的貢獻(xiàn)率為13.8%，‘克朗德’、‘胡依阿’和‘西維特’被劃分在PC2坐標(biāo)軸的上方，‘米莉格’被劃分在PC2坐標(biāo)軸的下方。其余9個(gè)白三葉品種主要分布于坐標(biāo)軸原點(diǎn)附近。主成分分析結(jié)果與遺傳聚類(lèi)圖的表現(xiàn)基本一致。

圖3 13個(gè)白三葉品種的主成分分析

2.4 13個(gè)白三葉品種指紋圖譜的構(gòu)建

以篩選出的多態(tài)性引物擴(kuò)增出的電泳圖為基礎(chǔ)，選擇6對(duì)具有代表性的引物gtrs1164，gtrs573，gtrs541，gtrs171，gtrs536和gtrs173構(gòu)建DNA指紋圖譜。如圖4所示，gtrs573的178 bp，gtrs171的190 bp，gtrs541的205 bp，gtrs541的170 bp和gtrs536的265 bp可以直接將‘克朗德’、‘游俠’、‘超級(jí)胡依阿’、‘麥克’和‘歐米克’分別區(qū)別出來(lái)。在gtrs171的170 bp處僅有‘歐米克’和‘米莉格’出現(xiàn)了多態(tài)性條帶，而‘米莉格’在gtrs573的237 bp處沒(méi)有多態(tài)性條帶，因此可以將這兩個(gè)白三葉品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。通過(guò)此種方法還可以在gtrs536的153 bp和gtrs171的135 bp將‘胡依阿’區(qū)分出來(lái)。在gtrs573的155 bp僅有‘艾麗絲’和‘羅特’沒(méi)有多態(tài)性條帶，而gtrs536的214 bp處‘羅特’出現(xiàn)了多態(tài)性條帶，因此這兩對(duì)引物還可以將‘艾麗絲’和‘羅特’區(qū)別開(kāi)來(lái)。同理，在gtrs536的214 bp和gtrs541的182 bp，gtrs573的178 bp和gtrs541的163 bp，gtrs1164的210 bp和180 bp，gtrs173的170 bp和gtrs541的255 bp可以將‘超級(jí)海法’、‘金寶’、‘海法’、‘西維特’分別鑒別出來(lái)。結(jié)果表明，6種引物可以區(qū)別13份白三葉品種，通過(guò)這6對(duì)引物所構(gòu)建的DNA指紋圖譜具有較強(qiáng)的鑒定、區(qū)別這13個(gè)白三葉品種的能力。因此，本試驗(yàn)所選擇的引物具有較強(qiáng)的品種鑒別能力。

圖4 基于部分多態(tài)性引物擴(kuò)增的13份白三葉品種的DNA指紋圖譜

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，可為植物育種提供重要信息，能夠反映物種的遺傳背景以及利用價(jià)值，甚至能夠保護(hù)和發(fā)掘優(yōu)良種質(zhì)[18]。SSR分子標(biāo)記能夠反映被標(biāo)記生物的DNA，已被廣泛應(yīng)用在品種[19]及純度鑒定[20]和遺傳多樣性分析[21]。本試驗(yàn)利用SSR研究13個(gè)引進(jìn)白三葉品種種質(zhì)資源的多樣性，結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記在13個(gè)白三葉品種中具有較高多態(tài)性，試驗(yàn)所用20對(duì)SSR引物共檢測(cè)到13個(gè)品種的104條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率(PPB)達(dá)90.4%，高于李莉等[22]利用SSR標(biāo)記分析花序一致的貴州野生白三葉品種研究中的PPB(85.99%)，且黃婷等[23]利用SSR標(biāo)記進(jìn)行多花黑麥草的品種鑒定研究中的PPB(88.81%)也低于本研究。試驗(yàn)引物篩選自Griffiths等[16]報(bào)道的白三葉遺傳連鎖圖譜，通過(guò)對(duì)染色體不同片段位置上的引物進(jìn)行均勻選擇，將所選的264對(duì)SSR引物進(jìn)行初篩，基于“多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、條帶清晰穩(wěn)定”的原則，共篩選出20對(duì)引物。

本試驗(yàn)研究的對(duì)象白三葉是一種典型的依靠蜜蜂等蟲(chóng)媒傳粉的異花授粉植物，易產(chǎn)生遠(yuǎn)距離間基因的交流。因此，要進(jìn)行種質(zhì)資源收集時(shí)，應(yīng)先制定有效的取樣策略[24]。為了準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)遺傳多樣性和進(jìn)行品種鑒定，選擇最佳的樣本量是實(shí)現(xiàn)品種擴(kuò)容的必要條件。在群體內(nèi)取樣單株數(shù)量方面，Sjogren和Wyoni[25]提出了一個(gè)針對(duì)有限群體的假設(shè)模型，認(rèn)為若要檢測(cè)到頻率為5%的稀有等位基因，群體內(nèi)的樣本量至少要達(dá)到30個(gè)單株。陳堅(jiān)等[26]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)異花授粉植物紫云英進(jìn)行分析時(shí)，闡述群體內(nèi)的樣品取樣量以30單株為宜，即可達(dá)到較佳鑒別效果又降低分析成本。針對(duì)品種內(nèi)部的取樣重復(fù)數(shù)量，K?lliker等[15]將所取的白三葉單株進(jìn)行分塊，每個(gè)樣本被劃分成3個(gè)獨(dú)立的混樣池(Bulk)，此種方法可有效的利用AFLP技術(shù)對(duì)白三葉遺傳多樣性進(jìn)行分析。同樣，Ma等[27]也使用了此種分塊方法利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)10份白三葉品種進(jìn)行品種鑒定。鑒于以上研究，本試驗(yàn)采用每個(gè)品種30個(gè)單株構(gòu)建了3個(gè)獨(dú)立的混樣池(Bulk)對(duì)13個(gè)白三葉品種進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果表明，此種取樣策略可以有效區(qū)分白三葉草品種。這與前人的研究結(jié)果一致。

在自然異花授粉植物居群中，品種間的變異幅度小于品種內(nèi)部的變異[23]。白三葉作為異花授粉植物，具有較大的群體內(nèi)差異，且各育種材料間的頻繁交流使得品種間存在較小的變異程度[28]。然而，本試驗(yàn)中，品種內(nèi)與品種間的變異幅度差異不大，主要原因可能是這13個(gè)白三葉品種絕大部分為國(guó)外育成新品種，且來(lái)源地廣、地理區(qū)隔比較大，使得品種純度較高，品種間差異增大，內(nèi)部差異減小。從分子水平上說(shuō)，遺傳相似系數(shù)越小，變幅越大，則表明該物種的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景也就越復(fù)雜[29]。本研究13個(gè)白三葉品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)分布在0.556～0.739，最大的遺傳相似系數(shù)出現(xiàn)在白三葉品種‘海法’和‘超級(jí)海法’之間。這可能是由于‘超級(jí)海法’在選育過(guò)程中是基于‘海法’白三葉為親本選育，故兩者具有較近的親緣關(guān)系。而最小的遺傳相似系數(shù)出現(xiàn)在‘米莉格’和‘克朗德’之間，表明盡管兩個(gè)品種均來(lái)自丹麥地區(qū)，但可能由于引種過(guò)程中環(huán)境差異的影響導(dǎo)致了兩個(gè)品種之間遺傳距離較大，出現(xiàn)因環(huán)境變化產(chǎn)生的基因突變，同時(shí)也表明引進(jìn)品種中存在較高的遺傳多樣性，具有較高的利用價(jià)值[30]。

品種或種質(zhì)資源的特異性是新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)的科學(xué)依據(jù)[31]。利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建品種指紋圖譜，可以快速準(zhǔn)確的進(jìn)行品種(系)的鑒定，同時(shí)具有很強(qiáng)的個(gè)體特異性，為作物育種和種子管理工作提供了極大的便利[32]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)作為比較理想的分子標(biāo)記技術(shù)之一[33]，已被廣泛應(yīng)用于高羊茅(FestucaarundinaceaS.)[34]、多花黑麥草[35]、紅三葉(TrifoliumpratenseL.)[36]等多個(gè)物種的品種鑒定。本研究先篩選出具有較高多態(tài)性的均勻分布在白三葉染色體上的SSR引物，再經(jīng)過(guò)人工篩選20對(duì)多態(tài)性較好的SSR引物構(gòu)建DNA指紋圖譜，對(duì)13份白三葉品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。根據(jù)已構(gòu)建DNA指紋圖譜分析，13份白三葉品種均可通過(guò)SSR引物進(jìn)行品種鑒定。遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜的構(gòu)建對(duì)白三葉種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育及鑒定均具有積極的作用，也可為新品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)與有效利用提供保障。就本研究而言，隨著白三葉國(guó)外品種的不斷引進(jìn)且篩選的引物數(shù)量有限，特征條帶也可能在其它品種中出現(xiàn)，因此目前的引物組合在一定的材料范圍內(nèi)適用。

4 結(jié)論

本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)外引進(jìn)13個(gè)白三葉品種進(jìn)行聚類(lèi)分析并篩選利用6種具有代表性的引物構(gòu)建DNA指紋圖譜。本研究探討了13份白三葉品種之間的親緣關(guān)系，同時(shí)也使用所構(gòu)建的DNA指紋譜圖將白三葉品種清晰、有效的鑒別出來(lái)。研究表明，DNA指紋圖譜的構(gòu)建對(duì)鑒定和區(qū)分白三葉新品種具有重要意義。