高原早熟禾根際促生菌分離篩選及特性研究

趙樹棟， 李建宏

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

甘南草原是指我國青藏高原東北部甘肅省甘南藏族自治州境內的天然草地，具有很強的草地畜牧業生產優勢，被譽為“亞洲第一牧場”，也是黃河首曲最大的生態濕地，是我國西部地區重要的生態屏障和水源涵養地。但是近年來，受氣候變化和人類活動的雙重影響，甘南草原退化明顯，有數據顯示，甘南草原退化面積已達到總面積的56.6%左右[1]，草原保護與治理刻不容緩。前人研究發現，甘南草原退化主要體現在草地植被的退化和草地土壤質量下降2個方面[2]。近些年學術界以及草原管理部門嘗試了多種不同的草地治理措施，如輪牧、封育、施肥、劃破草皮、人工補播等[6]，這些措施在一定范圍內取得了積極的效果，為退化草地治理工作積累了寶貴的經驗[7]。對于退化較為嚴重的草地，目前使用較多的治理措施是人工補播和施肥，但是，補播植物的種子發芽率、成活率以及生長狀況受外界因素影響很大，且草地施肥成本高、對生態系統擾動大[7-8]，因此，提高補播植物的發芽及生長能力，綠色、高效的提高草地土壤肥力，是目前退化草地治理的重要工作。植物根際促生菌技術的出現為解決這一問題提供了新的思路。

研究表明，在植物的根際定殖著一大類對植物生長有益的細菌，被稱為植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，這類細菌生活在植物根際系統中(定殖于根系表面或生活在根際土壤中)，具有固氮、溶磷、解鉀、拮抗病原菌或產生植物激素等功能[9]。PGPR是寶貴的功能微生物資源，也是微生物肥料和微生物農藥的重要原料，對于農業技術的提高和農業可持續發展具有重要的意義[10-14]。研究表明，植物根際促生菌不僅可以促進植物的生長，更能改良土壤質量、提高土壤肥力。對于解決退化草地補播植物的生長問題和草地土壤肥力問題具有積極意義，已有學者進行了此方面的嘗試并取得了富有價值的成果，如何敏[15]從藏北高原土著植物根際分離篩選了促生菌，并以其為材料，研究促生菌對植物及其土壤的影響，結果發現，促生菌可以提高植物對不良環境脅迫的耐受能力，促進植物生長，并能改良土壤微生物群落結構，提高土壤活性。馬驄毓等[16]則從阿里地區高寒草地披堿草(ElymusnutansGriseb.)根際分離篩選了促生菌，并嘗試將其制成菌劑，結果表明該菌劑不僅能促進披堿草的生長，更能提高披堿草的飼用價值。因此，利用植物根際促生菌進行退化草地修復具有很強的可行性。

高原早熟禾(PoapratensisL.)是重要的飼草作物，是甘南草原高寒草地優勢牧草之一[17]，具有重要生態及經濟價值，也是甘南地區退化草地人工補播的常用草種之一，但作為禾本科植物，其對氮、磷元素需求量較大，而退化草地氮、磷素較為缺乏，成為了早熟禾生長的限制因素。因此，提高土壤中有效氮、磷元素的含量就是一項十分重要的工作，植物根際促生菌在此方面有巨大的應用潛力。但目前，對于早熟禾根際促生菌的研究尚較為欠缺。鑒于此，為了探索和發掘新的生物資源，為退化草地的治理作出積極探索。本研究從甘南草原高寒草地高原早熟禾根際分離篩選促生菌，并對其特性進行研究和評價，以期為進一步開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

采樣區位于甘肅省甘南藏族自治州碌曲縣，位于甘肅西南部(101°35′36″～102°58′15″E，33°58′21″～34°48′48″N)，甘肅、青海、四川三省交界處，青藏高原東部邊緣，地形以山地和盆地為主，地勢西高東低，平均海拔3 500 m，其氣候呈現春秋短促、長冬無夏、陰濕高寒的特點，屬青藏高原氣候帶高原濕潤氣候區，年降水量633～782 mm，平均氣溫 2.3℃，無絕對無霜期，年總日照時數2 357.8 h，太陽總輻射量 51 983.9 J·cm-2[18]。草場面積較大，達39.4萬hm2，占全縣土地總面積的83.3%，高原早熟禾是其優勢牧草之一。

1.2 樣品采集與處理

于2020年7月在研究區圍欄內休牧草地采集生長旺盛、無病蟲害的高原早熟禾根際樣品(包括植物根系和土壤)，將取得的樣品裝入無菌聚乙烯袋中，低溫運輸至實驗室立即進行菌株分離。

分離時為了方便研究細菌在植物根際的分布，將根際分為根際土壤(Soil adhering to roots,RS)、根系表面(Rhizoplan or surface of roots，RP)與根內(Histoplan or interior of roots，HP)3個區域[19-20]。

1.3 高原早熟禾根際促生菌的分離與純化

1.3.1聯合固氮菌的分離與純化 在無氮培養基(Nitrogen free medium，NFM)[19-20]表面運用涂布平板法分離純化聯合固氮菌。分別取已制備的3個區域的10-3,10-4,10-5稀釋液50 μL接種于NFM固體培養基上。每個區域的每個梯度稀釋液各重復 3次，用無菌涂布器均勻涂抹到培養基表面，28℃的培養箱中培養3 d后計數，計算固氮菌的數量[19-20]。

NFM培養基配方為：蘋果酸 5.0 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，生物素 10 μg，0.5%溴麝香草酚藍5 mL，瓊脂 2%，總體積 1 000 mL，pH值 7.0。

1.3.2溶磷菌的分離與純化 溶解無機磷菌株運用平板涂布法在無機磷培養基(Pikovaskaia's，PKO)[9]表面分離純化。溶解有機磷菌株運用平板涂布法在蒙金娜有機磷培養基[21]表面分離純化。用移液器分別取已制備的3個區域的10-3,10-4,10-5稀釋液50 μL接種于滅菌的選擇性PKO無機磷與蒙金娜有機磷固體培養基上。每個區域的每個梯度稀釋液在培養基上各重復3次，用無菌涂布器均勻涂抹到培養基表面，28℃的培養箱中培養5 d后，觀察并計數菌落周圍能形成溶磷透明圈的單個菌落。分別測量并記錄溶磷圈直徑(D)、菌落直徑(d)，并計算溶磷圈直徑和菌落直徑的比值(D/d)，記錄溶磷菌的數量[21]。

PKO無機磷培養基配方：Ca3(PO4)25.0 g，葡萄糖 10.0 g，NaCl 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.2 g，MnSO4·H2O 0.002 g，瓊脂18.0 g，酵母膏 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，總體積 1 000 mL，pH值7.0±0.2。

蒙金娜有機磷培養基配方：葡萄糖 10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，蛋黃卵磷脂 0.2 g，CaCO35.0 g，酵母膏 0.4 g，瓊脂18.0 g，總體積 1 000 mL，pH值7.0～7.5。

1.4 菌株特性研究

以分離篩選的菌株為材料，根據初篩結果，從中挑選特性較好的菌株(溶磷培養基上D/d的值大于1.5或在固氮培養基上菌落明顯，生長較快的菌株)進行進一步的特性研究。

菌株固氮能力的測定采用乙炔還原法(Acetylene reduction assay，ARA)，以固氮酶活性表示；溶磷能力的測定采用鉬藍比色法(Molybdenum blues colorimetry，MBC)；菌株分泌植物激素IAA能力測定采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)；菌株抑制植物病原菌能力的測定采用平板對峙法，根據抑菌圈的直徑計算抑制率[19-21]。

1.5 種子發芽率、發芽指數、幼苗活力指標的測定

挑選飽滿、無破損的高原早熟禾種子(由甘肅農業大學草業學院提供)，0.5% H2O2消毒10 min，無菌水沖洗5次，處理組分別用不同待測菌株的菌懸液(培養24 h后離心獲得，懸浮于無菌生理鹽水，108CFU·mL-1)浸種1 h，用無菌生理鹽水做對照，每個處理設4次重復，每個培養皿中擺放50粒種子，25℃恒溫培養，光照12 h，濕度80%，每日補充蒸發損失的水分，統計種子的發芽數，直至發芽結束，高原早熟禾發芽周期參照《國家草種子檢驗規程》[22]。發芽結束后統計正常種苗數，并測定高原早熟禾幼苗的根長、芽長、根鮮重和芽鮮重。

參考Williamson等[23]和李鈺瑩等[24]的方法，分別計算不同處理下高原早熟禾的發芽率、發芽指數、幼苗活力指數等指標，計算公式為：

發芽率(Germination percentage,GP):GP(%)=(Gn/N)×100%。

式中，Gn為截止發芽周期最后一天正常發芽的種子總數，N為供試的種子總數。

發芽指數(Germination index,GI):GI= ∑(Gt/Dt)

式中，Gt為第t天種子的發芽數，Dt代表相應的發芽天數。

幼苗活力指數(Seeding vigor index，SVI)：SVI=GI×S。式中，S為發芽周期結束時的芽長。

1.6 高原早熟禾生長指標的測定

栽培用土的準備：將準備好的混有蛭石的土壤過3 mm的土壤篩，輻照滅菌(委托蘭州綠源輻照有限責任公司完成)，裝入已消毒的花盆(直徑18 cm，深19 cm)備用。

種子的催芽及栽培：種子消毒(同1.5)后催芽處理，發芽后挑選長勢一致的幼苗進行栽培。每盆栽培15株，栽培7 d后間苗，留下長勢一致的幼苗，每盆留苗10株。

菌液處理：將活化后的待測菌株接種于LB培養液，180 r·min-1，28℃培養，血球計數板檢驗菌體濃度，待菌體濃度達到108CFU·mL-1時終止培養，用移液槍吸取培養液，滴加到幼苗根部，每苗加2 mL，滅菌的LB培養液作對照，每處理4次重復。置于室溫、自然光下培養，定期澆水。

指標測定：第30 d測定高原早熟禾的株高、根長、地上生物量、地下生物量等指標。

1.7 菌株分類

菌株表型特征觀察：活化菌株，進行菌落形態觀察、芽孢染色、革蘭氏染色。

16S rRNA基因分析：用試劑盒(OMEGA)提取菌株總DNA，瓊脂糖凝膠電泳法分析DNA的純度，紫外分光光度法測定DNA純度。引物選用16S rRNA基因擴增通用引物27F-1492R[25]，序列分別為：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，均由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。PCR擴增反應體系和擴增反應程序參照李建宏[25]的方法。擴增產物檢測合格后直接送交測序，測序工作委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。獲得序列后登陸NCBI數據庫，進行BLAST比對。使用CLUSTALX 1.83 軟件和MEGA 5.1.2軟件構建菌株系統進化樹。

1.8 數據分析

采用Excel 2016進行數據整理，SPSS 19.0軟件對試驗數據進行One-Way ANOVA分析和Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 PGPR在高原早熟禾根際的分布

由表1可知，從高原早熟禾根際共分離出32株PGPR，其中固氮菌最多，有15株，溶無機磷菌次之，為11株。PGPR在高原早熟禾根際不同部位的分布也不同。無論是固氮菌，還是溶磷菌，在根際的分布都是根系表面>根際土壤>根內，呈典型的“根際效應”。

表1 PGPR在高原早熟禾根際的分布

2.2 PGPR菌株的促生特性

由表2可知，根據初篩結果，從高原早熟禾根際分離出的32株菌株中挑選出Pa-2，Pa-4，Pa-7，Pa-21和Pa-29等5株特性優良的菌株，進行進一步研究。

由表2可知，具有溶無機磷能力的菌株有4株，其D/d值在1.63～2.19之間，Pa-4最高，為2.19，顯著高于其他3株(P<0.05)；菌株在無機磷培養基中的pH值與D/d值趨勢相反，Pa-4最低，為3.61，差異顯著(P<0.05)，Pa-29最高，達5.42；定量測定結果顯示，溶無機磷能力最強的菌株為Pa-4，其溶無機磷的能力達到274.30 μg·mL-1，顯著高于Pa-2，Pa-21和Pa-29(P<0.05)，與D/d的變化趨勢基本一致。具有溶解有機磷能力的菌株有3株，在有機磷培養基上，D/d值最高的是Pa-4，為1.69；pH值最低是Pa-4，為4.22，最高的為Pa-2，為5.29；定量測定的結果與pH值及D/d值的趨勢不同，溶解有機磷能力最強的菌株為Pa-2，達128.39 μg·mL-1，其次是Pa-4，為52.98 μg·mL-1。

表2 優良PGPR菌株溶磷能力

由表3可知，不同菌株的固氮酶活性不同，菌株間差異顯著(P<0.05)，在5株待測菌株中，具有固氮酶活性的菌株有4株，固氮酶活性強的為Pa-7，固氮酶活性達652.65 nmol(C2H4)·h-1·mL-1，其次為Pa-29為320.90 nmol(C2H4)·h-1·mL-1，Pa-2次之，Pa-4相對較弱。而5株待測菌株均檢測出了分泌IAA的能力，但不同菌株的分泌能力不同，處在9.62～76.16 μg·mL-1之間，分泌IAA能力最強的菌株為Pa-7，其IAA的值為76.16 μg·mL-1，顯著高于其他4株(P<0.05)。

表3 優良PGPR菌株固氮酶活性及分泌IAA能力

2.3 PGPR菌株對病原菌的抑制率

由表4可知，本研究的5株待測菌株對3種常見病原菌均具有一定的拮抗能力，但不同菌株的拮抗能力不同，同一菌株對不同病原菌的拮抗能力也不同。抑菌能力最強的菌株為Pa-21，其對燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、立枯絲核菌(R.solani)、麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)的抑制率均高于其他待測菌株，分別達92.11%，82.47%和85.20%。其他待測菌也具有不同程度的抑菌能力。

表4 優良PGPR菌株對病原菌的抑制率

2.4 PGPR菌株對高原早熟禾種子萌發的影響

由表5可知，和CK相比，促生菌可以較為顯著的提高高原早熟禾種子的萌發率(P<0.05)，促生菌浸種后，高原早熟禾種子的發芽率提高了1.65%～4.40%，其中Pa-4菌株浸種后發芽率提高最為明顯，提高了4.40%；促生菌株處理后發芽指數提高了21.56%～78.11%，Pa-4菌株浸種后發芽指數提高幅度高達78.11%；促生菌浸種后，高原早熟禾幼苗的活力指數同樣有較為顯著的提升(P<0.05)，提高了7.33%～23.06%。

表5 優良PGPR菌株對高原早熟禾種子萌發的影響

2.5 PGPR菌株對高原早熟禾生長的影響

由表6可知，和CK相比，用促生菌處理后，高原早熟禾的株高、根長、地上生物量、地下生物量等指標均有顯著提升(P<0.05)；促生菌處理后，早熟禾的株高提升7.18%～25.97%；根長增加8.2%～27.87%；地上生物量增加24.2%～57.58%；地下生物量增加36.36%～54.55%，各指標均以Pa-4菌株促進效果最好。

表6 優良PGPR菌株對高原早熟禾生長的影響

2.6 PGPR菌株分類地位的確定

結合菌株形態鑒定結果與16S rDNA序列分析結果(表7)，對5株待測菌株的分類地位進行確定，結果發現，Pa-2和Pa-7為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，Pa-4為蕈狀芽孢桿菌(Bacillusmycoides)；Pa-21和Pa-29分別為不動桿菌(Acinetobactersp.)與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。圖1為5株菌的系統進化分析，根據參比菌株的遺傳進化距離對比可以發現，本研究的鑒定結果準確。將測得的序列提交GenBank數據庫，獲得了GenBank登錄號，分別為MW805692-MW805696。

表7 菌株鑒定結果

圖1 基于16S rRNA基因采用N-J鄰接方法建立本研究菌株與其它近似菌株的系統進化樹

3 討論

草地的退化主要體現在2個層面，一是草地植被的退化，如草地植被高度、蓋度、物種多樣性、草產量等的下降，以及優質牧草比例的下降、毒雜草比例的提高等等；二是草地土壤的下降，包括土壤鹽堿化、肥力下降、物理性質劣化以及土壤微生物多樣性的降低[3-5]。李建宏等[26]在東祁連山高寒草地的研究還表明，草地退化過程中還伴隨著固氮微生物豐度的下降[26]，另有學者指出，草地退化減少了草地土壤氮庫[27]。而固氮微生物和土壤氮庫的降低，直接導致了草地土壤肥力的下降，土壤肥力的下降又使得牧草營養缺乏，植被進一步退化，因此，在本質上，草地退化是植被—土壤系統的協同退化[7]。由此，退化草地的修復也應該是從植被—土壤系統耦合的思路來進行修復。縱觀近些年國內大多數草原管理者的修復方案，無論是人工補播還是草地施肥，都是從單一層面進行修復，雖然也在一定程度上取得了積極的效果，但是其局限性也很明顯，一是補播的牧草成活率低、生長狀況差；二是草地土壤養分循環能力未得到根本性的提高，僅靠外源的補給很難使其進入良性循環[6-8]。本研究顯示，植物根際促生菌不僅具有溶磷、固氮、分泌植物激素等功效，提高土壤肥力，還可以有效提高牧草種子的發芽率和幼苗活力，促進牧草的生長，正好解決了退化草地修復難題，具有良好的應用前景。除此之外，越來越多的學者們認識到傳統的修復措施對原有生態系統有一定的擾動和破壞，其負面影響不可忽視，因此提出了“近自然修復”的理念[28-31]。該理念強調在草地修復的同時，要尊重原有的生態系統。而植物根際促生菌是“源于自然，用于自然”的，因此，也是退化草地“近自然修復措施”必不可少的措施。

本研究還發現植物根際促生菌可以促進牧草種子的發芽，提高發芽率、發芽指數以及幼苗活力指數，朱詩苗[32]的研究發現，使用促生菌后，煙草(NicotianatabacumL.)種子發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數分別增加了 30.61%，8.36%，31.13%，36.9%，苗長和根長分別增加了11.37%和57.11%，與本研究的結果相似。推測其原因，一是促生菌分泌的植物激素促進了種子的萌發[33]；二是促生菌通過自身代謝作用，分解了抑制種子發芽的物質[34]，促進了種子的發芽。而種子發芽之后，促生菌還可以促進幼苗對養分的吸收，雙重作用導致了促生菌對種子萌發的促進作用。但是關于其機理，目前尚缺乏深入的研究。

4 結論

從高原早熟禾根際共分離出32株具有促生作用的菌株，促生菌在高原早熟禾根際的分布呈“根際效應”。挑選出的5株優良菌株有不同程度的溶磷、固氮及分泌植物的能力，均能提高高原早熟禾幼苗的發芽率、發芽指數、幼苗活力指數，并能促進高原早熟禾幼苗的生長；5株優良菌株中，有2株枯草芽孢桿菌，1株蕈狀芽孢桿菌，1株不動桿菌以及1株熒光假單胞菌。本研究為進一步的深入研究和功能微生物資源開發奠定了基礎。