響應(yīng)面法優(yōu)化綠蘿花多酚超臨界CO2萃取工藝

董新艷，高文懿，阮璽如，吳志革，趙世淳

(浙大寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100)

綠蘿花是瑞香科、結(jié)香屬的植物滇結(jié)香的花蕾[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前綠蘿花中已經(jīng)檢出多酚、多糖、脂肪酸等多種化合物[2-7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證實(shí)綠蘿花作為一種名貴藏藥材具有治療糖尿病、冠心病、高血壓等功效[8-9]，這可能由于其富含多酚化合物[2，10]。目前，有關(guān)綠蘿花的研究報(bào)道僅限于揮發(fā)油、還原糖的提取分離及其抗氧化、降血糖等藥理作用及機(jī)制研究[11-12]，尚未有綠蘿花中多酚的超臨界提取工藝的相關(guān)報(bào)道。本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)綠蘿花中多酚的超臨界提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為綠蘿花作為功能性食品及藥物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

綠蘿花，購(gòu)自青海優(yōu)草商貿(mào)有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥89.9%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；Folin Ciocalteu試劑(2N)，上海荔達(dá)生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、無(wú)水Na2CO3均為分析純，；高純CO2(純度≥99%)。

Spe-ed SFE-Z 2402AC型超臨界流體萃取儀；752PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；FA2004電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將干燥后的綠蘿花蕾粉粹成粉末，過(guò)4號(hào)篩(65目)。稱取綠蘿花粉末0.7 g，裝入不銹鋼萃取柱中，將萃取柱接入超臨界流體萃取儀的氣體管路，調(diào)節(jié)溫度為50 ℃和壓力為30 MPa，使得萃取流體處于超臨界狀態(tài)，調(diào)節(jié)夾帶劑的流速0.4 mL/min，動(dòng)態(tài)萃取2 h。

1.3 分析方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制濃度為0.146 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取2.5，3，4.5，7，8.5，10 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL棕色容量瓶中，用去離子水定容。分別移取不同濃度沒(méi)食子酸溶液1 mL于25 mL棕色容量瓶中，分別加入2 mL福林酚原液，靜止 8 min 后，再各加入 6 mL 7.5% Na2CO3溶液，用去離子水定容至25 mL，搖勻后靜置于25 ℃恒溫槽中進(jìn)行顯色反應(yīng)2 h，于波長(zhǎng)760 nm下測(cè)量其吸光度。以吸光度值和沒(méi)食子酸濃度為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=5.789 96X-0.057 32(R=0.999 58)。

1.3.2 綠蘿花中多酚得率的測(cè)定 超臨界萃取結(jié)束后，將接收瓶中的提取液進(jìn)行旋蒸，并用80%乙醇定容于25 mL容量瓶中，從中移取3～10 mL于棕色容量瓶中，用去離子水定容。取1 mL稀釋后的樣品溶液至25 mL的棕色容量瓶中，按1.3.1節(jié)采用Folin-Ciocalteu[13]比色法測(cè)定多酚含量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚得率。

式中C——通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的多酚濃度，mg/mL；

m——稱取的花的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇夾帶劑的濃度對(duì)多酚得率的影響 以乙醇水溶液為夾帶劑，提取壓力為30 MPa，萃取溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為2 h，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察夾帶劑(乙醇水溶液)中乙醇的體積分率對(duì)綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，夾帶劑(乙醇水溶液)中乙醇的體積分率升高，多酚得率先增加再減小，在乙醇濃度為70%時(shí)，多酚得率出現(xiàn)峰值。這主要是由于多酚類物質(zhì)均含有酚羥基，具有一定的極性。萃取溶劑的極性過(guò)大或者過(guò)小均對(duì)多酚得率具有一定的影響。當(dāng)夾帶劑中乙醇濃度過(guò)低時(shí)，含水量大，造成萃取溶劑的極性過(guò)大；當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，萃取溶劑的極性又過(guò)小，因此高乙醇濃度及低乙醇濃度的夾帶劑均不能將一定極性的多酚全部萃取出來(lái)，造成多酚得率較低。含70%乙醇的夾帶劑，極性更為適中，對(duì)具有特定極性的多酚具有較高的提取效率。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響

2.1.2 萃取壓力對(duì)多酚得率的影響 萃取溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為2 h，以70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))的水溶液為夾帶劑，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察萃取壓力對(duì)綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 萃取壓力對(duì)多酚得率的影響

由圖2可知，多酚得率隨著萃取壓力的增大而增加，這是由于超臨界流體的密度隨著壓力的增加而增加，尤其是在低壓段，密度隨壓力的變化更為敏感[13]。因此，超臨界流體的溶劑化能力也隨密度增加而增強(qiáng)，對(duì)多酚的溶解能力也增大，從而多酚得率增加。此外，過(guò)高的壓力對(duì)設(shè)備的要求更高，動(dòng)力消耗更大。因此，萃取壓力以30 MPa左右為宜。

2.1.3 萃取溫度對(duì)多酚得率的影響 提取壓力為30 MPa，萃取時(shí)間為2 h，以70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))的水溶液為夾帶劑，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察萃取溫度對(duì)綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 萃取溫度對(duì)多酚得率的影響

由圖3可知，溫度上升，多酚得率先上升，>50 ℃時(shí)又下降。這主要是由于溫度對(duì)萃取效果具有雙重影響：首先，隨著溫度升高，超臨界流體的擴(kuò)散系數(shù)與溶質(zhì)的揮發(fā)性增加，使得溶質(zhì)與溶劑間的傳質(zhì)效率增強(qiáng)，對(duì)溶質(zhì)的溶解萃取有正影響；另一方面，隨著溫度增加，超臨界流體密度下降，對(duì)溶質(zhì)的溶解萃取有不利影響。因此，50 ℃為較適宜的萃取溫度。

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 提取壓力為30 MPa，萃取溫度50 ℃、70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))的水溶液為夾帶劑，夾帶劑流速為0.4 mL/min，考察萃取時(shí)間對(duì)綠蘿花中多酚萃取得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

由圖4可知，多酚得率隨著萃取時(shí)間的增大而增大，這主要是由于多酚在超臨界流體中溶解隨著時(shí)間增加而更加充分。然而，萃取時(shí)間若長(zhǎng)于2 h后，由于多酚在萃取劑中溶解達(dá)到平衡，造成多酚的得率緩慢增加。而當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)2.5 h，多酚得率略有下降，這可能是由于萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多酚類物質(zhì)氧化或分解。綜合考慮，選擇提取時(shí)間為2 h。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑乙醇濃度為實(shí)驗(yàn)因素，以多酚萃取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2.2.1 模型建立及模型方差分析 響應(yīng)面的設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，為了估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，本次實(shí)驗(yàn)中共進(jìn)行了5次中心實(shí)驗(yàn)。采用Design expertV 8.06 軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑濃度(C)與多酚得率間的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=-84.102 94+0.392 35A+1.820 28B+1.307 75C-4×10-5AB-4.862 5×10-4AC+1.223 75×10-3BC-6.4×10-3A2-0.018 865B2-0.010 112C2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 多酚得率的響應(yīng)曲面分析 根據(jù)擬合模型，利用Design expert軟件繪制交互因子的響應(yīng)面及其等高線圖，見(jiàn)圖5～圖7，顯示了萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑濃度(C)中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)多酚得率的影響。

圖5 萃取壓力和萃取溫度對(duì)多酚得率的影響

圖6 萃取壓力和乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響

圖7 萃取溫度和乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響

圖5為當(dāng)采用含70%乙醇(體積分率)的乙醇水溶液為夾帶劑時(shí)，萃取壓力和萃取溫度對(duì)綠蘿花中多酚萃取得率的影響。

當(dāng)萃取溫度一定時(shí)，多酚得率隨著萃取壓力的增加而增加；而當(dāng)萃取壓力一定時(shí)，隨著萃取溫度變化，多酚得率先增加后減小。這說(shuō)明響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)范圍的最大值。

圖6為當(dāng)萃取溫度為50 ℃時(shí)，萃取壓力和乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響。

當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，多酚得率同樣隨著萃取壓力的增加而增加；當(dāng)萃取壓力一定時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率先增加后減小。同時(shí)可以看出，多酚得率隨著乙醇濃度的變化幅度明顯高于隨萃取壓力的變化幅度。此外，從等高線圖也可以看出，沿乙醇濃度軸的等高線密度變化相對(duì)沿壓力軸的變化大。以上均可說(shuō)明夾帶劑濃度對(duì)多酚得率的影響比壓力顯著，與方差分析結(jié)果相符合。

圖7為當(dāng)萃取壓力為20 MPa時(shí)，萃取溫度和乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響。當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，隨萃取溫度的變化，多酚得率先增后減，變化趨勢(shì)較平緩；當(dāng)萃取溫度一定時(shí)，多酚先增加后減小，變化幅度陡峭，說(shuō)明夾帶劑濃度的主效應(yīng)大于萃取溫度，與方差分析結(jié)果相符合。同時(shí)，觀察其等高線圖，沿乙醇濃度軸向等高線密集，而沿萃取溫度軸等高線相對(duì)稀疏，同樣說(shuō)明夾帶劑濃度對(duì)多酚得率的影響高于萃取溫度。

2.2.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 運(yùn)用Design expert軟件對(duì)綠蘿花多酚得率二次多項(xiàng)回歸模型進(jìn)行最優(yōu)化求解，得到最優(yōu)最佳工藝條件為：萃取壓力為27.94 MPa、萃取溫度為50.39 ℃、夾帶劑為含67.4%乙醇(體積分率)的乙醇水溶液。在此條件下，多酚理論得率為11.077 8 mg/g。為便于實(shí)驗(yàn)操作，將各條件調(diào)整為萃取壓力為28 MPa，萃取溫度為50.4 ℃，夾帶劑為67%乙醇(體積分率)的乙醇水溶液，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得綠蘿花中多酚得率為(11.015±0.15)mg/g，與理論值相比誤差僅為0.56%，說(shuō)明該模型擬合度較高、有效可行。

3 結(jié)論

超臨界CO2萃取綠蘿花中多酚的最佳工藝條件為：萃取壓力為28 MPa，萃取溫度為50.4 ℃，夾帶劑為67%乙醇(體積分率)的水溶液。在此條件下，多酚得率達(dá)(11.015±0.15)mg/g，與理論值誤差0.56%。